+
Действующая цена700 499 руб.
Товаров:
На сумму:

Электронная библиотека диссертаций

Доставка любой диссертации в формате PDF и WORD за 499 руб. на e-mail - 20 мин. 800 000 наименований диссертаций и авторефератов. Все авторефераты диссертаций - БЕСПЛАТНО

Расширенный поиск

Структурная организация функционально активных комплексов РНК полимеразы E. coli с факторами транскрипции GreA и GreB. Идентификация и анализ промоторных мишеней для GreA E. coli и Gfh1 T. thermophilus

  • Автор:

    Озерова, Мария Владимировна

  • Шифр специальности:

    03.00.03

  • Научная степень:

    Кандидатская

  • Год защиты:

    2009

  • Место защиты:

    Пущино

  • Количество страниц:

    88 с. : ил.

  • Стоимость:

    700 р.

    499 руб.

до окончания действия скидки
00
00
00
00
+
Наш сайт выгодно отличается тем что при покупке, кроме PDF версии Вы в подарок получаете работу преобразованную в WORD - документ и это предоставляет качественно другие возможности при работе с документом
Страницы оглавления работы

ОГЛАВЛЕНИЕ
СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Бактериальная ДНК-зависимая РНКП
1.1.1. Субъедгтичный состав и функции РІТКП
1.1.2. Каталитические активности РНКП
1.1.3. Транскрипционный цикл
1.1.4. Структура РНКП (кор- и холо-ферменты, бинарный и элонгационный комплексы)
1.1.5. Каталитический центр и подвижные элементы вторичного канала РНКП (G-петля, F-мостик, jaw-домен)
1.2. Бактериальные транскрипционные факторы, модулирующие активность РНКП через вторичный канал
1.2.1. Общие сведения о функциях и биологическая роль
1.2.2. Структуры
1.2.3. Механизм действия
1.2.4. Модели комплексов с РНКП
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы и реагенты
2.2. Методы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Детальный анализ взаимодействия Gre-факторов с РНКП и механизма их действия
3.1.1. Картирование пространственного расположения Gre-белков в РНКП
3.1.2. Определение пространственного расположения неконсервативного регуляторного домена G-петли относительно элементов РНКП и ДНК в эпонгационном комплексе
3.1.3. Определение положения консервативной части G-петли во вторичном канале необходимого для связывания Gre-белков с РНКП
3.1.4. Альтернативные положения Gre-белков во вторичном канале РНКП
3.1.5. Моделирование структуры комплекса Gre-РНКП
3.2. Роль расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции на ряде промоторов Е
3.2.1. Анализ эффекта GreA на образование полноразмерного РНК-продукта на промоторах выбранных по данным экспрессионного анализа на микроматрицах!А
3.2.2. Анализ расщепляющей активности GreA на абортивный синтез РНК
3.3. Определение функциональной мишени для действия Gre-подобного ингибитора транскрипции - Gfhl из Thermus thermophilus
3.3.1. Анализ активности Gfhl на ряде промоторов Thermus thermophilus in vitro
3.3.2. Анализ эффекта Gfhl на Км для НТФ при инициации и элонгации транскрипции!9 ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
РНКП

тДНК
нтДНК
п.н.

пДНК
гДНК
ПЛАТ

дНТФ

скаффолд
«откатившийся» ЭК

РНК полимераза элонгационный комплекс каталитический центр цикл добавления нуклеотида транскрибируемая цепь ДНК нетранскрибируемая цепь ДНК пара нуклеотидов нуклеотид
константа Михаэлиса транскрипционный буфер плазмидная ДНК геномная ДНК полиакриламидный гель додецилсульфат натрия нуклеозидтрифосфат дезоксинуклеозидтрифосфат пирофосфат
P’-F-спираль (Bridge helix)
Р’-G-петля (Trigger loop)
модельная матрица, представляющая собой комплекс отожженных синтетических олигонуклеотидов
элонгационный комплекс (backtracked), образовавшийся в результате перемещения каталитического центра РНКП («откатывания» РНКП) на одну из внутренних фосфодиэфирных связей РНК-транскрипта молекулярная масса

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Транскрипция генов является первым этапом реализации генетической информации у всех живых организмов. Ключевыми ферментами, катализирующими этот процесс в эукариотических и прокариотических клетках, являются многосубъединичные ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП), осуществляющие комплементарный синтез РНК-транскрипта на ДНК-матрице [1, 2]. Многосубъединичные РНКП ответственны за синтез практически всех клеточных РНК. Их аминокислотные последовательности содержат большое число консервативных областей, а данные кристаллографических исследований демонстрируют сходство пространственной организации. Более простое строение бактериальных РНКП (6 субъединиц) по сравнению с эукариотическими, содержащими до 17 субъединиц (РНКГ1 III), делает их прекрасной моделью для изучения клеточных РНКП в целом. Все они используют общий механизм катализа (нуклеофильное замещение), основанный на присутствии двух ионов Mg2+ в активном центре фермента; достигают высокой процессивности в фазе элонгации, формируя РНК-ДНК гибрид одинаковой длины; имеют сходство в механизмах процессов инициации, элонгации и терминации синтеза РНК.
Процессивность РНКП во многом связана с ее способностью образовывать прочную связь как с транскрибируемой ДНК, так и с растущей цепью РНК. Однако, несмотря на эту особенность, в процессе удлиннения транскрипта РНКП движется по ДНК-матрице с непостоянной скоростью, с паузами различной продолжительности, способными привести к транскрипционному аресту - конформационному состоянию, при котором процесс удлиннения РНК становится невозможен несмотря на целостность ЭК [3]. Как паузы, так и аресты возникают в результате смещения РНКП на одну из внутренних фосфодиэфирных связей РНК, что приводит к разрыву связи между ее 3'-концевым нуклеотидом и активным центром РНКП (комплекс в этом случае называется «откатившимся») [4, 5].
Таким образом, сложность транскрипции и необходимость ее координации для множества генов во время клеточного роста и в ответ на различные изменения внешней среды в бактериальных клетках требует строгого контроля активности РНКП. Принято считать, что основная регуляция этого процесса осуществляется ДНК-связывающими белками на стадии взаимодействия РНКП с промотором и инициации синтеза РНК. Однако существует еще один класс регуляторов — белковые (факторы, взаимодействующие с РНКП в области ее вторичного канала и непосредственно влияющие на процесс катализа. В эту группу входят белки семейств Gre (GreA, GreB и Gfhl), DksA (DksA, TraR) и Rnk, которые обладают структурной гомологией, но сильно различаются функционально.
Gre-подобные белки, для которых накоплен большой объем генетических и биохимических данных, являются прекрасными моделями для изучения регуляции транскрипции через вторичный канал РНКП. В экспериментах in vitro Gre-белки стимулируют синтез РНК за счет (1) ускорения перехода от инициации к элонгации, (2)

Vent (2 Ед/мкл); арктическая фосфатаза (5 Ед/мкл); щелочная фофатаза СІР (10 Ед/мкл); Т4 ДНК-лигаза (400 Ед/мкл); ДНКазаІ (100 Ед/мкл); эндонуклеазы рестрикции (Fermentas, Литва; NEB); соответствующие стандартные коммерческие буферные растворы.
2.1.9. Бактериальные штаммы: штамм НВ8 T.thermophilus и штамм MRE600 E.coli (Bioexpression and Fermentation Facility, University of Georgia, США); штаммы E. coli: BL21(DE3) генотипа E.coli В F dem ompT hsdS(rümn) gal X (DE3) (Stratagene, США); DFI5a генотипа F- (p80lacZAM15 A(lacZYA-argF) Ul69 recAl endAl hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 X-thi-1 gyrA96 relAl (Invitrogen, США), CAG 3016 генотипа MG1655 rpoB114(sck6)cps F4::TnlO, Rif, Tcr (любезно предоставлен проф. K. Севериновым).
2.1.10. Плазмиды: Все плазмиды (кроме рЕТЗЗЬ) несут маркер устойчивости к ампициллину и ИПТГ-индуцируемые промоторы. рЕТЗЗЬ несет маркер устойчивости к канамицину и ИПТГ-индуцируемый промотор.
Используемые плазмиды:
Плазмида Описание Источник
PTRC99A Экспрессирующий вектор, под контролем tre промотора Pharmacia, США
рЕТ19Ь Экспрессирующий вектор, под контролем промотора фага Т7 Novagene, США
рЕТЗЗЬ Экспрессирующий вектор, под контролем промотора фага Т7 Novagene, США
pCYB2b' С-РКА Экспрессирует ген гроС с сайтом фосфорилирования для РКА и 6xHis на С-конце. Под контролем tac промотора Предоставлена проф. К. Севериновым
pMOl.lhis greА, несущий 6xHis на С-конце, в pTRC99A Кулиш Д. и сотр., 1997
pM01.4his greВ, несущий 6xHis на С-конце, в pTRC99A Кулиш Д. и сотр., 1997
pETgreB53 gre В C68S/K53C, несущий 6xHis и РКА-сайт на N-конце, клонирован в рЕТ19Ь Кулиш Д. и сотр., 1997
pETgreB78 gj-eB C68S/S78C, несущий 6xHis и РКА-сайт на N-конце, клонирован в рЕТ19Ь Ломакин И. и сотр., 1997
pETgreB68 gre В C68S, несущий 6xHis и РКА-сайт на N-концс, клонирован в рЕТ19Ь Ломакин И. и сотр., 1997
pETgreA58 grek C58S, несущий ôxHis и РКА-сайт на N-конце, клонирован в рЕТ19Ь Предоставлена проф
2.2. Методы
2.2.1. Методы работы с культурами клеток Е. соїі Ночная культура: Единичную колонию бактерий с чашки Петри переносили в 2.5 мл жидкой питательной среды ЬВ (с ампицилином - для селективного роста бактерий) и

Рекомендуемые диссертации данного раздела

Время генерации: 0.124, запросов: 967