Факторы, влияющие на скорость и эффективность котрансляционного сворачивания белка

• Автор: Светлов, Максим Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКОВ
1.1. Гипотеза котрансляционного сворачивания белка
1.2. Скорость и эффективность котрансляционного
формирования дисульфидных связей
1.3. Скорость и эффективность котрансляционного
формирования нативной структуры
1.4. Котрансляционная олигомеризация белков
Глава II. ФАКТОРЫ КОТРАНСЛЯЦИОННОГО СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКА
2.1. Вклад векторности синтеза белка на рибосоме
в его котрансляционное сворачивание
2.2. Влияние скорости синтеза белка на его котрансляционное сворачивание
2.3. Вклад фиксации С конца растущего полипептида на
рибосоме в его котрансляционное сворачивание
2.4. Влияние рибосомного окружения растущей полипеп-
тидной цепи на её котрансляционное сворачивание
2.4.1. Стартовая конформация растущего полипептида,
задаваемая в пептидил-трансферазном центре рибосомы
2.4.2. Путь растущей цепи от пептидип-траисферазного
центра к выходу из рибосомы
2.4.3. Сворачивание растущей попипептидной цепи
внутри рибосомы
2.5. Вклад молекулярных шаперонов в котрансляционное
сворачивание белка

2.5.1. Молекулярные шапероны семейства Шр70
2.5.2. Молекулярные шапероны семейства НврбО
Глава III. ЛЮЦИФЕР АЗА СВЕТЛЯКА РНОТШШ РУКАЫБ
3.1. Свойства фермента
3.2. Люцифераза как объект исследований сворачивания
белков
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава I. ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОТРАНСЛЯЦИОННОГО СВО-
РАЧИВАНИЯ ЛЮЦИФЕР АЗЫ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ТРАНСЛЯЦИИ
Глава II. ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНОВ НА КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ
СВОРАЧИВАНИЕ ЛЮЦИФЕР АЗЫ
2.1. Активность шаперонов Ньр70 в бактериальной бес-
клеточной системе трансляции
2.2. Эффективность котрансляционного сворачивания
люциферазы в присутствии шаперонов НБр70
2.3. Длительность пост-трансляционного сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии
шаперонов Нэр70
2.4. Длительность пост-трансляционного сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии
триггер фактора
Глава III. СВОРАЧИВАНИЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫ С ИММОБИЛИЗО-
ВАННЫМ НА МАССИВНОЙ ЧАСТИЦЕ С КОНЦОМ
3.1. Сворачивание полипептидной цепи люциферазы,
иммобилизованной на гранулах сефарозы
3.1.1. Иммобилизация С конца люциферазы на гранулах
хелирующей сефарозы
3.1.2. Сворачивание полипептидной цепи люциферазы на
гранулах сефарозы

3.1.3. Зависимость эффективности ренатурации
люциферазы от концентрации белка
3.1.4. Ренатурация иммобилизованной люциферазы
при разной ионной сше
3.2. Ренатурация люциферазы, иммобилизованной на рибосоме
в виде пептидил-тРНК
3.2.1. Иммобилизация С конца люциферазы на 70Б
рибосоме
3.2.2. Ренатурация люциферазы, иммобилизованной на
7ОБ рибосоме
3.2.3. Влияние триггер фактора наренатурацию связанной
с рибосомой люциферазы
Глава IV. ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ СИНТЕЗА ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ НА ЕЁ КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ СВОРАЧИВАНИЕ
4.1. Влияние температуры на котрансляционное
сворачивание люциферазы
4.2. Влияние скорости синтеза люциферазы на эффективность её котрансляционного сворачивания
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ
МЕТОДЫ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

же время пост-трансляционное добавление шаперона в систему трансляции не оказывало влияния на активность синтезированного фермента. Авторы объяснили это тем, что DnaJ (в отсутствие DnaK и GrpE) прочно связывается с растущей цепью и препятствует её сворачиванию. Эффективное сворачивание связанной с DnaJ неактивной люциферазы происходило после пост-трансляционного добавления DnaK и GrpE в систему трансляции. На основании этих результатов было сделано предположение о том, что DnaJ, связываясь с растущей цепью, вовлекает в её котрансляционное сворачивание белки DnaK и GrpE.
Как было отмечено выше, клетки, лишённые гена dnaK, жизнеспособны при нормальных температурных условиях. Следовательно, сворачивание большинства синтезируемых при нормальной температуре в бактериальной клетке белков не нуждается в участии шаперона Hsp70. Однако было обнаружено, что делеция гена tig из бактериальных клеток AdnaK штамма приводит к их гибели при 37°С (Teter et al., 1999). Также показано, что удаление этого гена из клеток дикого типа не сказывается на их жизнеспособности, но при этом увеличивается количество растущих цепей, связанных in vivo с шапероном DnaK. Авторы сделали предположение, что шаперон Hsp70 и продукт гена tig принимают совместное участие в котрансляционном сворачивании белков в клетке.
Бактериальный ген tig кодирует белок триггер фактор, молекулярная масса которого составляет 48 кДа. Известно, что синтез этого белка не зависит от температуры, то есть он не является белком теплового шока. В то же время, эксперименты in vitro по ренатурации разных белков в присутствии триггер фактора показали, что он проявляет как активность молекулярного шаперона, так и активность пептидил-пролил цис-транс изомеразы. Так, триггер фактор существенно ускоряет ренатурацию рибонуклеазы Т1, скорость-лимитирующей стадией сворачивания которой является изомеризация пептидной связи между остатками тирозина-38 и пролина-39 (Scholz et al., 1997). Также было показано, что фактор способен связываться с развёрнутой цепью глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и увеличивать выход активного фермента при ренатурации, предотвращая его межмолекулярную агрегацию (Huang et al., 2000). Примечательно то, что для эффективной ренатурации белка в присутствии триггер фактора не требуется АТФ.
Ещё одной особенностью, отличающей триггер фактор от подавляющего большинства других шалеронов, является его способность специфически связываться с большой субчастицей вакантной рибосомы (Lill et al., 1988). Было показано, что