Влияние трансдоминантных ингибиторов на функциональную активность онкосупрессора р53

• Автор: Моргункова, Анна Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Г лава 1. Молекулярная организация и эволюция семейства генов р 53.
Г лава 2. Регуляция экспрессии гена р53.
Глава 3. Доменная организация белкар53.
N-концевой трансактивационный домен SH3-прол иновы й домен
- ДНК-связывающий домен Олигомернзационный домен
- С-концевой регуляторный
Г лава 4. Функции белка р53.
- р53-зависимая трансактивация
- р53-зависимая трансрепрессия и белок-белковые взаимодействия
- р53-зависимый контроль клеточного цикла
- р53-зависимый апоптоз
Выбор пути: остановка клеточного цикла или апоптоз?
- р53 в процессах репарации и репликации ДНК
- р53 в процессах клеточной дифференцировки и развития организма
- р53 и ангиогенез
- р53 и старение
Глава 5. Регуляция функций р53.
- Механизмы регуляции функций р
- Регуляция стабильности р
- Регуляция активности р
- Регуляция субклеточной локализациир
Глава 6. Роль р53 в онкогенезе.
“Gain of function ’’-мутации р
- Доминантно-негативные ши транс-доминантные мутации р
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Получение компетентных клеток Escherichia coli и трансформация.

2. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.
3. Обработка ДНКрестрицирующими эндонуклеазами.
4. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.
5. Реакция лигирования.
6. Полимеразная цепная реакция и экстракция РНК из эукариотических клеток.
7. Клеточные линии и их культивирование.
8. Лизис клеток и измерение концентрации белка по методу Бредфорда.
9. Иммунопреципитация белков и ковалентное соединение моноклональных антител с белком А на сефарозе.
10. Фращионирование белков в полиакриламидном геле.
11. Перенос белков на фильтры и иммунодетекция.
12. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструкций методом калыщй-фосфатной преципитации.
13. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами и селекция на антибиотике устойчивых культур.
14. Анализ активности /3-галактозидазы (Х-%а1-реакция).
15. Иммунофлуоресцентный анализ содержания белков в клетках.
16. Детекция апоптотической клеточной смерти (ТиМЕ!.-реакция, обработка клеток аннексином/флуоресцеином и хехстом 33258).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
wt (wild type) - дикий тип;
р53- нативный wt-p53 человека;
р53^',„- химерный wt-p53 человека, в котором олигомеризационный домен белка заменен на олигомеризационный домен р53 курицы;
р53)и р53'.^т - К175Н-мутанты нативного и химерного р53 человека
соответственно;
GSE22 - Genetic Suppressor Element 22.
ВВЕДЕНИЕ
Ген р53 - один из наиболее ярких и интенсивно исследуемых представителей генов-супрессоров опухолевого роста. Он (или его аналог) присутствует не только в геномах всех позвоночных, но также, по-видимому, в геномах всех многоклеточных организмов, что подчеркивает его значимость. Продукт гена - тетрамерный белок р53 является одним из важнейших транскрипционных факторов и регуляторов клеточного цикла и апоптоза. В нормально пролиферирующих клетках р53 - короткоживущий белок с быстрой оборачиваемостью: время его жизни не превышает 20 минут. При генотоксических и цитотоксических стрессах р53 быстро стабилизируется за счет посттрансляционных ковалентных модификаций, сопровождающихся прекращением его деградации, что приводит к резкому повышению концентрации белка в клетке. Белок сосредотачивается в клеточном ядре, переходит в активированную для сайт-специфического связывания с ДНК форму, и за счет активации или репрессии транскрипции генов-мишеней “включает” программы:
1) остановки клеточного цикла на время репарации возникших повреждений ДНК, 2) клеточной смерти по типу апоптоза или 3) необратимого клеточного старения. В итоге многоклеточный организм избавляется от клеток с повреждениями генетического аппарата, способными к опухолевой трансформации. В связи с этой охранной функцией р53 был назван хранителем целостности и стабильности генома. Помимо своих основных функций р53 участвует также в процессах репарации и репликации ДНК, развития и старения организма, клеточной дифференцировки и ангиогенеза, оказывая, таким образом, плейотропное воздействие на организм. Функции р53 в

работы, чтобы позволить клетке дальше продвигаться по циклу. Считается, что главньми механизмами регуляции функций р53 являются посттрансляционные ковалентные модификации белка и белок-белковые взаимодействия, модулирующие функциональную активность р53 (Meek D.W., 1999). Предполагается, что тип и аминокислотный сайт модификации р53, а также сигнальный путь и способ передачи стресс-сигнала на р53, зависят от характера этого сигнала (Giaccia A.J. et al„ 1998). Например, активация онкогенов “включает” р53 преимущественно через его взаимодействия с белком ARF, а облучение - через ковалентные модификации N- и С-концевых доменов р53, причем ионизирующие и ультрафиолетовые лучи задействуют разные сигнальные пути и/или модифицируют разные аминокислотные остатки р53 (Lakin N.D. et al., 1999; Meek D.W., 1999). Ковалентные модификации р53 включают: фосфорилирование (дефосфорилирование), ацетилирование (деацетилирование), рибозилирование, О-гликозилирование, убикитинирование и модификации убикитин-родственным белком - SUMO-1 (small ubiquitin-like modifier 1) - “сумойалирование”.
Фосфорилирование р53.
In vitro показано, что существует множество потенциальных сайтов фосфорилирования р53, причем они сконцентрированы на N- и С-концевых доменах белка. У человека это серины 9, 15, 20, 33, 37, 315, 376, 371, 378, 392 и треонин 18; у мыши серины 4, 6, 9, 15, 18, 34, 309, 386 и треонины 73, 83. Множество протеинкиназ задействовано in vitro в этом процессе: CKI и СКИ (casein kinase I and II), Cdks (cyclin dependent kinases), CAK (Cdk-activating kinase), DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), ATM (ataxia-teleangiextasia mutated), ATR (ATM and Rad3 related), JNK (Jun amino-terminal kinase), МАРК (mitogen-activated protein kinases): ERK1 и ERK2 (extracellular signal regulated kinase 1 and 2), PKA (protein kinase A), PKC (protein kinase C), PKR (protein kinase activated by double-stranded RNA), Raf. In vivo, однако, достоверно пока показано участие в фосфорилировании р53 человека лишь трех киназ PIKK (phosphoinositide 3 kinase related kinases)-ceMeftcTBa: ATM, ATR и DNA-PK (Jimines G.S. et al., 1999; Lakin N.D. et al., 1999; Meek D.W., 1999).
Герминальные мутации гена ATM связаны с мультисистемным аутосомно-рецессивным заболеванием - атаксией-телеангиэктазией, сопровождающейся прогрессирующим разрушением мозжечка, телеангиэктазией, преждевременным старением, иммунологическими нарушениями, хромосомной нестабильностью и повышенной чувствительностью к ионизирующему облучение - риск развития рака при этом возрастает в 100 раз. Установлено, что протеинкиназа ATM активируется в ответ на ионизирующее (ИО), но не ультрафиолетовое (УФ) облучение (Khanna К.К. et