Молекулярная эпидемиология и современные методы генодиагностики фенилкетонурии в регионах России

• Автор: Бреннер, Евгений Владиславович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Введение
2.1.1. Метаболизм фенилаланина в норме
2.1.2. Нарушение метаболизма фенилаланина как причина фенилкетонурии
2.1.3. Материнская фенилкетонурия
2.1.4. Современная классификация форм фенилкетонурии
2.2. Распространенность фенилкетонурии
2.3. Структура фенилаланингидроксилазы
2.4. Структура гена ФАГ
2.5. Мутации гена ФАГ
2.6. Влияние мутаций гена фенилаланингидроксилазы на проявления фенилкетонурии
2.6.1. Моделирование влияния мутаций гена ФАГ на структуру
фенилаланингидроксилазы
2.6.2. Экспрессия in vitro как метод исследования эффекта мутаций на
активность ФАГ
2.6.3. Модель общего механизма влияния мутаций гена ФАГ
2.7. Нейтральные полиморфизмы и гаплотипы гена ФАГ, популяционная генетика
фенилкетонурии
2.7.1. Исследование полиморфизма сайтов рестрикции гена ФАГ
2.7.2. Исследование полиморфизма STR и VNTR повторов гена ФАГ
2.7.3. Исследование происхождения мутантных аллелей
2.8. Перспективные подходы к терапии фенилкетонурии
2.8.1. Диетотерапия
2.8.2. Генотерапия фенилкетонурии
2.8.3. Медикаментозная терапия фенилкетонурии
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.2. Методы
3.2.1. Обследованная группа
3.2.2. Консервирование крови
3.2.3. Выделение геномной ДНК из крови по Müller
3.2.4. Полимеразная цепная реакция
3.2.4.а) ПЦР районов гена ФАГ
3.2.4.6) РеЛЦР STR и VNTR гена ФАГ
3.2.5. Электрофорез в агарозном геле
3.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле
3.2.7. Очистка продуктов ПЦР
3.2.7.а) Очистка продуктов ПЦР сорбцией на стекловолокне
3.2.7.6) Гелъфтътрация продуктов ПЦР на колонках Centrisep Spin Columns
3.2.7.в) Гелъфилътраг{ия продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G-5058
3.2.7.г) Гельфильтрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G
3.2.8. Реакция Сэнгера
3.2.9. Очистка продуктов реакции Сэнгера
3.2.10. Фрагментный анализ продуктов ПЦР на автоматических генных анализаторах
3.2.10. а) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных нуклеозидтрифосфатов
3.2.10.6) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных праймеров
3.2.10.в) Спектральная калибровка генных анализаторов для выполнения фрагчентного анализа
3.2.10.г) Определение поправки между реальными и наблюдаемыми при фрагментном анализе размерами
3.2.11. Компьютерная обработка данных
3.2.11.а) Анализ электрофореграмм
3.2.11.6) Анализ секвенограмм автоматических генных анализаторов
3.2.11.в) Анализ электрофореграмм при фрагментном анализе
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Полиморфизм гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией Западной Сибири Алтайского края и Саратовской области
4.1.1. Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае
4.1.2. Минигаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с мутациями,
обуславливающими ФКУ в Западной Сибири и Саратовской области
4.2. Рекуррентное возникновение мутации гена фенилаланингидроксилазы Y168H

4.3. Пренатальная диагностика фенилкетонурии в семьях больных фенилкетонурией
4.4. Универсальный метода идентификации однонуклеотидных замен
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Локализация полиморфных локусов гена фенилаланингидроксилазы, аллельные варианты которых были идентифицированы в настоящей работе

внутриклеточных условиях. В частности, специфичность и чувствительность систем деградации белков значительно выше у эукариот. Настоящим результатом таких экспериментов является демонстрация того, что нарушение процессов сборки зрелого фермента является обычным для мутантных форм фенилаланингидроксилазы.
Использование двухгибридных систем экспрессии позволяет
производить полуколичественную оценку белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Как правило, используют системы, основанные на клетках дрожжей или млекопитающих. В этих экспериментах разные мономеры ФАГ экспрессируются как химерные белки: один с ДНК-связываюгцим мотивом, другой с активатором транскрипции. Взаимодействие двух мономеров ФАГ сближает эти мотивы, что приводит к активации репортерного гена. В ходе этих исследований для нескольких мутантных форм ФАГ было
продемонстрировано нарушение нормальных белок-белковых
взаимодействий, имеющих место у немутантных форм ФАГ.
2.6.3. Модель общего механизма влияния мутаций гена ФАГ.
Результаты, полученные при исследовании множества, обуславливающих фенилкетонурию мутаций гена ФАГ, послужили основой для формулирования общего механизма влияния этих мутаций на структуру и свойства фермента, и, как следствие, развитие фенилкетонурии.
Схема этого механизма приведена на рисунке 6.