Анализ полиморфизма неструктурных областей генома варианта ВИЧ-1, доминирующего в России

• Автор: Лаповок, Илья Андреевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

Содержание
Введение
Обзор литературы
1. Открытие вируса иммунодефицита человека первого типа
2. Строение вириона ВИЧ
3. Организация генома ВИЧ
3.1. Структура и функции LTR провирусной ДНК ВИЧ
3.1.1. Структура и функции Ш-региона 5’-LTR провирусной ДНК
3.1.2. Структура и функции R-региона 5’-LTR провирусной ДНК
3.1.3. Структура и функции 115-региона 5’-LTR провирусной ДНК
3.2. Структура области вирусной РНК, предшествующей gag-стартовому кодону
3.2.1. Вторичная структура и функции шпильки DIS (SL1) РНК ВИЧ
3.2.2. Вторичная структура и функции шпильки SD (SL2) РНК ВИЧ
3.2.3. Вторичная структура и функции шпильки |/ (SL3) РНК ВИЧ
3.2.4. Шпилька SL4
3.2.5. Ш-АСКЗ-дуплекс
3.2.6. Структура областей между шпильками
3.2.7. Пространственная структура и упаковка геномной РНК ВИЧ
3.3. Структурные гены ВИЧ
3.3.1. Ген gag
3.3.2. Ген рої
3.3.3. Ген ет
3.4. Гены и основные функции регуляторных и вспомогательных белков
3.4.1. Строение Vpr
3.4.2. Положение и синтез Vpr
3.4.3. Функции Vpr
3.4.3.1. Влияние на точность обратной транскрипции
3.4.3.2. Vpr и импорт в ядро преинтеграционного комплекса
3.4.3.3. Vpr и клеточный цикл
3.4.3.4. Разрушение двунитевой ДНК
3.4.3.5. Vpr и апоптоз
3.4.3.6. Роль Vpr в усилении LTR-направленной транскрипции
4. Этапы ВИЧ-инфекции
4.1. Ранняя и текущая инфекция
4.1. Дифференциальная диагностика ранней и текущей инфекции
5. Анализ полиморфизма ВИЧ-1 как инструмент эпидемиологического мониторинга
5.1. Деление вируса на подтипы
5.3. Природа изменчивости ВИЧ
5.2. Полиморфизм вируса
6. Молекулярный мониторинг ВИЧ-инфекции в России
6.1. Эпидемия ВИЧ-инфекции в России
6.2. Подтипы ВИЧ-1, обнаруживаемые в России
7. Генная терапия ВИЧ-инфекции
7.1. Терапии, базирующиеся на применении нуклеиновых кислот
7.2. Терапия, базирующаяся на белках
Экспериментальная часть
1. Материалы и методы
1.1. Объект исследования
1.2. Сбор эпидемиологических данных
1.3. Методы дифференциального анализа ранней и текущей инфекции

1.3.1. Чувствительный/низкочувствительный иммуноферментный анализ (S/LS ELISA)
1.3.2. Иммуноферментный анализ с использованием хаотропного агента
1.3.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41 (ИДЭ-цр41)
1.3.4. Изотип-специфический Western blot
1.4. Метод получения «грубых» лизатов мононуклеарных клеток периферической крови
1.5. Анализ электрофоретической подвижности молекул в агарозном геле
1.6. Применение метода гнездовой ПЦР для получения
ампликонов исследуемых областей ДНК
1.6.1. Амплификация нуклеотидных последовательностей области 5-LTR
1.6.2. Амплификация нуклеотидных последовательностей области,
предшествующей gag - стартовому кодону
1.6.3. Амплификация области гена vpr
1.7. Метод очистки ДНК из геля методом Jetquick
1.8. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК
2. Результаты
2.1. Сравнительный анализ лабораторных методов дифференциальной диагностики ранней ВИЧ-инфекции
2.1.1. Чувствительный/низкочувствительный ИФА
2.1.2. ИФА с использованием 8М мочевины
2.1.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41
2.1.4. Изотип-специфический Western blot
2.2. Анализ области 5-LTRпровирусной ДНК варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России
2.2.1. Филогенетический анализ области 5’-LTR
2.2.2. Анализ области U3
2.2.3. Анализ области R
2.2.4. Анализ области U5
2.3. Анализ области вирусной РНК, предшествующей gag-стартовому кодону варианта IDU-A ВИЧ
2.4. Анализ области гена vpr варианта IDU-A ВИЧ
2.4.1. Филогенетический анализ области гена vpr
2.4.2. Анализ мутаций в структуре гена vpr
Обсуждение
Выводы
Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВМН - конфигурация РНК, содержащая множественные шпилечные структуры IDU-A - вариант ВИЧ-1, принадлежащий к подтипу А группы М и доминирующий на территории России и стран СНГ
LTR - длинный концевой повтор в составе провирусной ДНК
MFNLP - область наиболее часто встречающихся длинных полиморфизмов
MSD - главный домен сплайсинга в составе шпильки SD
P-TEFb - позитивный фактор элонгации транскрипции b
RRE - регион присоединения вирусного белка Rev
TAR - регион присоединения вирусного белка Tat
Tat - трансактиватор транскрипции
TRM - мотив опознавания TAR
UTR - некодирующий концевой регион в составе вирусной РНК Vpr - вирусный белок R
ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия
ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа
ИФА - иммуноферментный анализ
МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови
ПИН - потребители инъекционных наркотиков
ПЦР - полимеразная цепная реакция

Два гидрофобных домена состоят из Trpl8-, Leu22- и Ьеи26-аминокислотных остатков с одной стороны и Ile63, Leu67, 11е70 и Ие74 - с другой стороны [Morellet et al, 2003]. Гидрофильные домены состоят из аминокислотных остатков Aspl7, Glu21, Glu24, Glu25, Asn28, Glu29 в структуре спирали I, Arg62, Arg73, Arg77 и Gln65, Gln66 - в структуре спирали III и Arg80, Arg87, Arg88, а также Arg90, Lys95 - в С-концевом регионе [Morellet et al, 2003] (рис. 10).
Рисунок 10. Трехмерная структура региона доменов белка Vpr ВИЧ-1. Гидрофобные и гидрофильные домены выделены красным и синим цветами, соответственно [адапт. из работы Morellet et al, 2003].
Состав пластичных N- и С-концевых регионов (между Metl - Glul3 и His78 -Ser96, соответственно) является одной из характеристик пространственной структуры Vpr [Morellet et al, 2003]. В N-концевом домене обнаружено четыре остатка пролина (в положениях 5, 10, 14 и 35), которые способны к цис/транс изомеризации [Le Rouzic et al, 2005; Bruns et al, 2003]. Есть сообщение, что клеточный циклофилин А способен взаимодействовать с Vpr через пролины в положениях 14 и 35, помогая правильному формировании вторичной структуры белка [Le Rouzic et al, 2005; Bruns et al, 2003]. Несмотря на то, что СООН-концевой регион Vpr от 84-й до 96-й аминокислоты очень изменчив, его присутствие необходимо для связи ДНК с Vpr [Tachiwana et al, 2006]. В нем выделяют домен, содержащий шесть аргининовых остатков между 73-м и 96-м положениями, который может отвечать за такое свойство Vpr, как его способность проникать через клеточную мембрану [Le Rouzic et al, 2005; Kichler et al, 2000]. На эту способность Vpr указывает тот факт, что этот белок обнаруживают как в сыворотке крови, так и в спинномозговой жидкости [Le Rouzic et al, 2005]. Кроме того, в С-концевой части на протяжении 60-81 аминокислотного остатка Vpr содержится Leu/Ile - богатый домен [Bourbigot et al, 2005].
3.4.2. Положение и синтез Vpr
Несмотря на участие Vpr во многих этапах жизненного цикла ВИЧ-1, он