Гидрогелевый клеточный микрочип для исследования внутриклеточных процессов и детекции химических соединений

• Автор: Фесенко, Денис Олегович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 91 с. : ил.

Список сокращений
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Технология биологических микрочипов
1.2. Аналоги клеточных микрочипов
1.3. Иммобилизация клеток. Гелевые основы для иммобилизации живых клеток
1.3.1. Агароза
1.3.2. Альгинат
1.3.3. Полиакриламид
1.3.4. ПАА-гидразид
1.4. Влияние иммобилизации микроорганизмов в ПААГ
на их жизнеспособность
1.5. Физиология и морфология иммобилизованных клеток,
характер роста в геле
1.6. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток
1.7. Выводы к главе
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы, штаммы и условия культивирования
2.2. Компоненты гелеобразующих растворов
2.2.1. Акриламид и бисакриламид
2.2.2. Персульфат аммония
2.2.3. ТЭМЕД
2.2.4. Полиакриламид-гидразид
2.2.5. Агароза, альгинат
2.2.6. Глицерин
2.3. Подготовка подложки для ГКМ
2.4. Оценка токсичности компонентов
2.5. Введение флюоресцентной метки в живые
бактериальные клетки
2.6. Регистрация флюоресценции и люминесценции
ячеек ГКМ. Обработка данных
2.7. Инкубационная камера
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГИДРОГЕЛЕВОГО КЛЕТОЧНОГО МИКРОЧИПА
3.1. Агарозный ГКМ
3.2. Полиакриламидный ГКМ
Влияние физических факторов
3.2.1. Влажность атмосферы
3.2.2. Размер ячеек
3.2.3. Температура полимеризиции
3.2.4. Скорость полимеризации
Влияние химического состава ГР
3.2.5. Акриламид и бисакриламид
3.2.6. Глицерин
3.2.7. Осмолярность ГР
3.2.8. Персульфат аммония
3.2.9. ТЭМЕД
3.2.10. Изготовление полиакриламидного
клеточного микрочипа
3.2.11. Установки для полимеризации ПКМ
Общие указания по изготовлению ГЖМ
3.3. Полиакриламид-гидразидный ГКМ
3.4. Альгинатный КМ
3.4.1. Способ химической пришивки альгината
к поверхности подложки
3.4.2. Изготовление альгинатного клеточного микрочипа
3.5. Хранение КМ
3.6. Выводы к главе
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ И ДЕТЕКЦИЯ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ КМ
4.1 Детекция антибиотиков
4.2. Количественный анализ антибиотиков
4.3. Мониторинг синтеза НК и белка у прокариот и дрожжей.
Оценка влияния веществ на синтез НК и белка у E.coli на примере хлорамфеникола
4.4. Обнаружение и количественое определение веществ, индуцирующих флюоресцентные и биолюминесцентные
репортеры
4.5. Выводы к главе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

приводит к гибели всех клеток. Вероятно, это происходит вследствие снижения их устойчивости к повреждающим факторам. Для создания изотонических условий применяли 0.9% NaCl и 0.3 М сахарозу.
3.2.8. Персульфат аммония
При комнатной температуре ПСА на жизнеспособность E.coli не влияет. Однако сочетание ПСА и ТЭМЕДа приводит к одномоментному образованию свободных радикалов, снижающих- жизнеспособность бактерий. С другой стороны, увеличение концентрации ПСА вызывает увеличение скорости полимеризации и, соответственно, повышению выхода жизнеспособных ИК.
3.2.9. ТЭМЕД
ТЭМЕД токсичен по отношению к бактериальным клеткам, но в применяемых нами концентрациях (1 мкл/дм3, в виде паров) он не оказывал заметного бактерицидного действия. Газообразный ТЭМЕД в концентрации 14 мкл/дм3 конденсировался на микрокаплях ГР, находящихся при 10°С, что приводило к гибели всех иммобилизуемых бактерий.
3.2.10. Изготовление полиакриламидного клеточного микрочипа (ПКМ).
В результате проведенной оценки влияния отдельных компонентов ГР и этапов изготовления ПКМ на жизнеспособность ИК, была разработана следующая технология изготовления. Процедура получения ПКМ включает в себя три основных этапа: (а) приготовление гелеобразующего раствора ПААГ,
содержащего иммобилизуемые клетки; (б) нанесение микрокапель полученной смеси на подложку; (в) полимеризация микрокапель с последующей отмывкой от непрореагировавших мономеров, глицерина и свободных клеток.