Прионные и неприонные амилоиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Вишневская, Александра Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Место защиты: Б.м.
• Количество страниц: 161 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Прионы млекопитающих
1.1. История открытия прионного белка PrPSc
1.2. Доказательства прионных свойств белка PrPSc
1.3. Свойства белка РгРс и его прионной изоформы PrPSc
1.4. Молекулярные механизмы прионного перехода
1.5. Существование межвидового барьера. Штаммы прионов
2. Амилоиды и амилоидозы
2.1. Амилоидозы человека
2.2. Структура амилоидных фибрилл
2.3. Любой ли белок может стать амилоидом?
2.4. Чем обусловлено различие в инфекционности прионов и амилоидов?
3. Прионы низших эукариот
3.1. Цитоплазматический детерминант [EIET-s] гриба Podospora anserina
3.2. Нехромосомный детерминант [URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.3. Детерминант [PSf: генетические проявления и молекулярная основа
3.3.1. Доказательства прионных свойств Sup35. Изучение прионного
перехода белка Sup35 in vitro
3.3.2. Структура и функции белка Sup35
3.3.3. Приояный домен Sup35: роль аминокислотного состава и
олигопептидных повторов в определении прионных свойств
3.3.4. Двухуровневая структура прионных агрегатов Sup35
3.4. Нехромосомный детерминант [iW1"] дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.5. Роль шаперона Hspl04 в поддержании [РЯЙ
3.6. Варианты [PSf]
3.7. Феномен мультикопийной супрессии
4. Исследование болезни Хантингтона в дрожжевой системе
4.1. Факторы, влияющие на агрегацию полиглутаминовых белков
4.1.1. Зависимость агрегации от экспрессии и количества остатков
глутамина
4.1.2. Взаимодействие шаперонов с полиглутаминовыми белками
4.1.3. Способность прионных и амилоидных белков инициировать
полимеризацию гетерологичных белков
5. Биологическое значение и распространенность в природе прионов и
амилоидов
6. Заключение. Постановка задачи исследования
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Среды, штаммы, условия культивирования
2. Генетические методы. Трансформация микроорганизмов
3. Конструирование плазмид и другие генно-инженерные манипуляции
4. Определение эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов в клетках
дрожжей
5. Флуоресцентная микроскопия
6. Экспрессия в E. coli и аффинная очистка белка -Rnq 1 -His(,
7. Получение и очистка антител к белку Rnql
8. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов
9. Белковый гель-электрофорез, иммуноблоттинг
10. Прионный переход белка Sup3 5 in vitro
11. Выделение амилоидных полимеров белка Sup35
РЕЗУЛЬТАТЫ

1. ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОИДНОГО СОСТОЯНИЯ БЕЛКА SUP35
1Л. Большая часть белка Sup35 при его сверхпродукции в клетках
[psi][PIN*] находится в амилоидной форме
1.2. Полимеры белка Sup35 содержат Rnql
1.3. Агрегация белка Sup35 приводит к супрессии нонсенс-мутаций
2. ИЗУЧЕНИЕ ПРИОННЫХ И АМИЛОИДНЫХ СВОЙСТВ ГИБРИДНЫХ
ПОЛИГЛУТАМИНОВЫХ БЕЛКОВ
2.1. Полимеризация гибридного белка Q66-Sup35MC ненаследуема
2.2. Полиглутаминовые и полиглутамин/тирозиновые последовательности длиной более 45 остатков полимеризуются in vivo
2.3. Влияние шаперона Hspl04 на полимеризацию полиглутаминовых белков.,
2.4. Способность белков polyQ к полимеризации в клетках Arnql зависит от длины полиглутаминовой последовательности
2.5. Кополимеризация полиглутамин-содержащих белков с другими глутамин-богатыми белками
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Свойства неприонных амилоидов бежа Sup3
2. Белки polyQ и polyQY эффективно образуют полимеры in vivo
3. Полимеры белков polyQ фрагментируются и могут быть прионами
4. Добавление тирозиновых остатков улучшает фрагментацию
полиглутаминовых полимеров
5. Фрагментация полимеров polyQY в отсутствие Hspl04
6. Взаимное ускорение полимеризации между различными амилоидогенными
белками
7. Межвидовой барьер в передаче прионного состояния
8. Прионы и неприонные амилоиды; два типа наследования (поддержания)
Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БКЯ - Болезнь Крейцфельда-Якоба
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
ГГТТТТТ - синдром Герстманна-Штрауссяера-Шейнкера
кДа - килоДальтон
ПААГ - полиакриламидный гель
DTT - дитиотреитол
EDTA - этилен диамин тетраацетат (EthyleneDiamineTetraAcetate)
CFP - синий флуоресцирующий белок (Cyan Fluorescent Protein)
GFP - зеленый флуоресцирующий белок (Green Fluorescent Protein)
YFP - желтый флуоресцирующий белок (Yellow Fluorescent Protein)
GuHCl - гидрохлорид гуанидина (Guanidine HydroChloride)
Htt - белок хантингтин (huntingtin) polyQ - полиглутаминовые белки
polyQY - полиглутаминовые белки, перемежающиеся с остатками тирозина SDS - додецил сульфат натрия (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDD-AGE - полуденатурирующий SDS электрофорез в агарозном геле (Semi Denaturating Detergent Agarose Gel Electrophoresis)
SDS-PAGE - SDS электрофорез в полиакриламидном геле (SDS- PolyAcrylomide Gel Electrophoresis)
ТАЕ - буфер трис-ацетат EDTA (Tris Acetate EDTA)
TBS - трис буфер с солью (Tris Buffer Saline)
PBS - фосфатный буфер с солью (Phosphate Buffer Saline)
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
являются как их безопасность и доступность, так и прекрасная разработанность в качестве генетического и молекулярно-биологического объекта. Использование дрожжей дало убедительные доказательства белковой природы инфекционное прионов. Дрожжи были использованы для проверки прионных и амилоидных свойств некоторых белков животных. Моделирование в дрожжах полимеризации пептида Альцгеймера и полиглутаминовых белков дает удобный инструмент для выявления клеточных факторов, принимающих участие в соответствующих амилоидозах.
Несмотря на значительный прогресс в изучении прионов и амилоидов, в этой теме остаются важные неизученные вопросы. Один из них состоит в том, чем отличаются прионы и амилоиды, что определяет инфекционность одних и неинфекционность других? У дрожжей инфекционность выражается не вполне так, как у животных: в передаче прионного детерминанта при скрещивании или
цитодукции клеток, а также его передаче при клеточных делениях. Тем не менее, дрожжи могли бы быть весьма удобны для изучения данного вопроса, при условии, что в них могут существовать неинфекционные (ненаследуемые) амилоиды. Обнаружение нами таких амилоидов в дрожжах позволило изучить и проанализировать из отличия от прионов, что и описано в представленной здесь работе.
Целью настоящей работы являлось изучение свойств, отличающих прионные и неприонные амилоидные полимеры. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследование прионоподобных полимеров белка ЭирЗ 5, возникающих при его сверхпродукции;
2. Изучение прионных и амилоидных свойств глутамин-богатых белков.