Изменчивость гена pol вариантов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) подтипа А, циркулирующих в России

• Автор: Суханова, Анна Львовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ (4)
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (8)
Глава 1. ФАКТОРЫ МИКРОЭВОЛЮЦИИ ВИЧ-1 IN VIVO (8)
1.1. Репликативный цикл ВИЧ-1 (8)
1.2. Механизмы генетической изменчивости ВИЧ-1 (9)
1.3. Скорость репликации ВИЧ-1, квазивиды, жизнеспособность (II)
1.4. Естественный отбор (13)
1.5. Антиретровирусная терапия как фактор отбора устойчивых вариантов ВИЧ-1 (14)
Глава 2. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА POL ВИЧ-1, НАПРАВЛЯЕМАЯ ФАКТОРАМИ ОТБОРА (16)
2.1. Структура и функция протеазы (17)
2.2. Ингибиторы протеазы (ИП) (19)
2.3. Механизмы развития устойчивости ВИЧ-1 к ИП (19)
2.4. Структура и функция обратной транскриптазы (24)
2.5. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) (27)
2.6. Механизмы развития устойчивости ВИЧ-1 к НИОТ (28)
2.7. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) (32)
2.8. Механизмы развития устойчивости ВИЧ-1 к ННИОТ (32)
2.9. Влияние клеточного иммунного ответа на вариации генаpol ВИЧ-1 (34)
Глава 3. ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ВИЧ В КОНТЕКСТЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ВАРИАНТОВ ВИРУСА (38)
3.1. Происхождение и генетическое разнообразие ВИЧ-1 (39)
3.2. Полиморфизм гена pol в отсутствие антиретровирусных препаратов (40)
3.3. Влияние генетического полиморфизма ВИЧ-1 на развитие лекарственной устойчивости (43)
3.4. Эпидемиология передающейся лекарственной устойчивости ВИЧ-1 (48)
Глава 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭПИДЕМИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ В РОССИИ (52)
4.1. Развитие эпидемии ВИЧ-инфекции в России и странах Ближнего Зарубежья (52)
4.2. Генетическая характеристика варианта ВИЧ-1 IDU-A, доминирующего в России (55)
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (57)
Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ (57)
1.1. Объект исследования (57)
1.2. Сбор клинико-эпидемиологических данных (58)
1.3. Получение «грубых» лизатов мононуклеарных клеток периферической крови (59)
1.4. Определение генетического подтипа ВИЧ-1 (59)
1.5. Амплификация фрагментов гена pol ВИЧ-1 (62)
1.6. Выявление мутаций V77I и A62V с помощью биологических микрочипов (64)
1.7. Выявление мутаций V77I и A62V с помощью рестрикционного анализа (66)
1.8. Электрофоретический анализ препаратов ДНК в агарозном геле (67)
1.9. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (68)
1.10. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей (70)
1.11. Статистическая обработка данных (70)
Глава 2. МУТАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ В НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ ГЕНА POL ВИЧ-1 ПОДТИПА А СРЕДИ ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ В РОССИИ, НЕ ПРИНИМАВШИХ АРВ-ПРЕПАРАТЫ (71)
2Л. Предварительная характеристика исследуемых образцов (71)
2.2. Построение консенсуса нуклеотдиных последовательностей гена pol ВИЧ-1 варианта IDU-A, опубликованных к началу настоящего исследования (72)
2.3. Доказательства принадлежности исследуемых нуклеотидных последовательностей гена pol подтипу А ВИЧ-1 (73)
2.4. Анализ аминокислотных последовательностей протеазы и ОТ ВИЧ-1 IDU-A (76)
2.5. Частота встречаемости мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 (77)
2.6. Анализ потенциального влияния мутаций в гене pol ВИЧ-1 IDU-A на эффективность антиретровирусной терапии (79)
Глава 3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЧЕТЫРЕХ ОБНАРУЖЕННЫХ В РОССИИ ВАРИАНТОВ ВИЧ-1 IDU-A, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ МУТАЦИЯМИ V77I В PRO И A62V В
RT (80)
3.1. Характеристика исследуемых групп (80)
3.2. Филогенетические взаимоотношения между вирусами четырех обнаруженных генотипов 1DU-A ВИЧ-1 (81)
3.3. Изменчивость гена pol обнаруженных вариантов IDU-A ВИЧ- 1 (84)
ГЛАВА 4. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВАРИАНТОВ ВИЧ-1 ПОДТИПА А ЧЕТЫРЕХ РОГ-ГЕНОТИПОВ В РАЗНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ В ПЕРИОД С 1996 ПО 2005 ГГ (87)
4.1. Изучение возможности применения биологических микрочипов и рестрикционного анализа для выявления мутаций V77I в pro и A62V в Rt (87)
4.2. Передача вариантов ВИЧ-1 IDU-A, несущих мутации V77I и/или A62V, в эпидемиологических цепочках (90)
4.3. Частота встречаемости pol-генотипов Wt, M1U771/62V, Mut77i и Mutfav ВИЧ-1 IDU-A в разных регионах России и ее изменение в ходе эпидемии в стране (90)
4.4. Частота встречаемости мутаций V77I в pro и A62V в Rt ВИЧ-1 IDU-A в регионах России (96)
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ (98)
I. Вопрос о передающейся лекарственной устойчивости ВИЧ-1 в России (98)
II. Генетическая гетерогенность вариантов ВИЧ-1 IDU-A, циркулирующих в России (100)
III. Обсуждение возможных причин преимущественного распространения в России варианта IDU-A с ро/-генотипом Mut77i/62v (106)
IV. Обсуждение данных о клиническом значении выявленных мутаций в гене pol (108)
выводы пт
ПРИЛОЖЕНИЕ (112)
I. Список сокращений (112)
II. Номера доступа в GenBank к нуклеотидным последовательностям (113)
III. Список литературы (114)
БЛАГОДАРНОСТИ (127)
Актуальность проблемы
Угроза, которую представляет инфекция вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) здоровью человечества, выражена тремя аспектами: неизбежностью летального исхода заболевания, глобальным масштабом эпидемии и отсутствием средств специфической профилактики инфекции. По данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД, в России на 10.04.2006 официально зарегистрировано 354031 случаев ВИЧ-инфекции; ежегодно увеличивается количество больных и умирающих от СПИДа (Покровский и соавт., 2005). Единственным известным на сегодняшний день средством, препятствующим прогрессии заболевания, является комбинированная антиретровирусная (АРВ) терапия, которая заключается в одновременном применении нескольких ингибиторов вирусных ферментов - протеазы и/или обратной транскриптазы (ОТ). Однако, основная проблема, осложняющая этиотропную терапию ВИЧ-инфекции, заключается в развитии устойчивости, или резистентности, вируса к действию лекарственных средств. Резистентные варианты вируса чаще всего возникают в популяции de novo как результат неоптималыюго подбора APB-препаратов или нарушения режима их приема, однако известны и случаи заражения устойчивыми штаммами ВИЧ-1 (Lukashov et al., 2000; Ammaranond et al., 2003). В условиях ограниченного доступа к лекарственным средствам, характерным для России в переходный период, вопрос о резистентности ВИЧ не только не перестает быть актуальным, но и приобретает особое значение. Монотерапия или битерапия с использованием ингибиторов вирусных ферментов может приводить к более быстрому развитию устойчивых вариантов ВИЧ, которые, передаваясь как вертикально, так и горизонтально, способны вызывать новые случаи инфекции. Очевидно, таким образом, что для широкомасштабного внедрения APB-терапии в стране необходима информация об уровне лекарственной устойчивости в популяции циркулирующих вариантов вируса, т.е. среди ВИЧ-инфицированных лиц, не употреблявших АРВ-препараты.
Основным способом анализа лекарственной устойчивости ВИЧ-1 является генотипирование, или выявление мутаций в геноме вируса, ответственных за ее развитие. Подавляющее большинство мутаций устойчивости ВИЧ-1 локализуется в области гена pol, кодирующей протеазу и первые 240 аминокислотных остатков (а.о.) ОТ. Выделяют два вида мутаций устойчивости ВИЧ-1 - первичные и вторичные. Первичные мутации непосредственно вызывают снижение чувствительности вируса к APB-препаратам, но при этом, как правило, ухудшают его репликативную способность. Вторичные мутации не влияют на уровень лекарственной устойчивости, но в большей или меньшей степени

в 27% (UK Collaborative Group on Monitoring and Transmission of HIV Drug Resistance, 2001 (цит. no: Soriano et al., 2004) ; за резистентность считали присутствие в геноме ВИЧ-1 одной или более первичных мутаций).
Табл. 0.2. Распространенность лекарственной устойчивости ВИЧ-1 среди новых случаев ВИЧ-инфекции
Ссылка Страна Период Кол-во лиц Частота (%) передающейся устойчивости ВИЧ-1 к APB-препаратам классов
Все НИОТ ННИОТ ИП
Yerly et al., 1999 Швейцария 1996-1998 82 10 10 2
Boden etal., 1999 США 1995-1999 80 16 13 8
Salomon et al., 2000 Канада 1997-1999 81 20 18 4
Wegner et al., 2000 США 1999 114 22 4 16
Briones et al., 2001 Испания 1997-1999 30 27 23 3
Little etal., 2002 США 1999-2000 108 14 8 7
Grant et al., 2002 США 2000-2001 91 27 21 13
Интересно, тем не менее, отметить, что динамика изменения частоты передачи + вариантов ВИЧ-1, резистентных к ингибиторам ОТ, часто оказывается бимодальной
показано на Рис. 0.14., на котором представлены результаты обследования 185 пациентов на острой стадии ВИЧ-инфекции в Сиднее, первый пик приходится на 1995 г. и является следствием широкого применения монотерапии АЗТ (Ammaranond et al., 2003а). О сходных данных, полученных в Нидерландах, сообщают Lukashov и соавт.: передача лекарственной устойчивости, которая была обусловлена только NAM, встречалась в 33% в 1995 г., после этого стала снижаться и в 1997-1998 гг. не детектировалась (Lukashov et al., 2000). И те, и другие авторы отмечают, что резкий спад темпов передачи резистентных штаммов ВИЧ-1, наблюдаемый после 1996 г., обусловлен внедрением в клиническую практику ВААРТ, в частности, включающей появившиеся тогда ИП. Для ВААРТ, которая заключается в • одновременном применении как минимум трех препаратов с разными механизмами
действия, характерно стойкое снижение вирусной нагрузки. Это, с одной стороны, препятствует быстрому развитию лекарственной устойчивости, а с другой стороны, снижает риск передачи вируса другому человеку (Yeni et al., 2004). Однако, как видно на Рис. 0.14., после спада снова регистрируется повышение частоты передачи резистентных вариантов
Рис. 0.14. Динамика частоты передачи вариантов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам ОТ, в Австралии. Черная
линия - первичные мутации, серая линия - вторичные мутации. По оси X представлены годы, в которые зарегистрированы исследуемые
случаи ВИЧ-инфекции, по оси У -частота мутаций (%) (Аттагапопб а1., 2003а).