Методы магнитно-резонансной томографии в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров

• Автор: Юдина, Анна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.02, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

Глава I. Литературный обзор
1.1 Ангиогенез: непременное условие для роста ракового новообразования
1.1.1 Ангиогенез и онкогенез
1.1.2 Механизмы ангиогенеза
1.1.3 Особенности опухолевых сосудов
1.2 Биохимия ангиогенеза
1.2.1 Ангиогенный переключатель
1.2.2 Основной игрок: сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецепторы
1.2.2.1 VEGF — ключевой фактор ангиогенеза
1.2.2.2 Семейство VEGF
1.2.2.3 Рецепторы VEGF
1.2.2.4 Регуляция экспрессии VEGF
1.2.2.5 Биологическое действие VEGF
1.2.3 Эпителиальный фактор роста и его рецептор
1.2.4 Прочие про-ангиогенные факторы
1.3 Анти-ангиогенез
1.3.1 Эндогенные анти-ангиогенные факторы
1.3.2 Обоснование анти-ангиогенной терапии
1.3.3 Обзор современных анти-ангиогенных препаратов
1.3.4 Гипотеза о нормализации сосудов. Потребность в надежных биомаркерах раннего ответа на анти-ангиогенную терапию
Глава II. Материалы и методы
II. 1 Клеточная культура
11.2 Флуоресцентные пробы
11.3 Контрастные МР-агенты
11.3.1 Gd-DTPA («Магневист»)
И.3.2 PGC-Gd
11.3.3 Gd-DTPA-diSer
11.4 МР-релаксометрия в изучении ангиогенеза
11.4.1 Метод релаксометрии
11.4.2 Описание РЧ-последовательностей для релаксометрии
11.5 МР-оценка изменения объема крови в опухоли, проницаемости сосудов и прочих параметров методами МРТ
11.5.1 Т1-метод оценки гемодинамических параметров. Описание
последовательности SPGR
11.5.2 Опухолевые модели
11.5.3 Магнитно-резонансное исследование мышей и анализ данных
11.5.4 Радиоизотопное исследование по определению фракции эритроцитов для коррекции значений абсолютного объема крови
11.5.5 Коррекция значений Vb
11.5.6 Гистологические методы для подтверждения соответствия данных МРТ происходящим в тканях процессам

II.6 Визуализация молекулярных маркеров ангиогенеза и онкогенеза методом магнитно-резонансной амплификации
11.6.1 Метод магнитно-резонансной амплификации
11.6.2 Синтез конъюгатов HRP-mab425 и GO-mAb425 (mAb Clone 425, anti-EGFR, Merck R&D)
11.6.3 Определение концентрации белка методом ВСА
11.6.4 Электрофорез SDS-PAGE (с додецилсульфонатом натрия)
11.6.5 Определение молярного соотношения замещения (Molar Substitution Ratio - MSR) для промежуточных продуктов GO-SHNH, HRP-SHNH, mab-SFB)
11.6.6 Гель-фильтрация (гель-хроматография)
11.6.7 Количественное определение EGFR на клеточной культуре (методом ELISA)
11.6.8 Тест конъюгатов на клеточной культуре (МРТ)
11.6.9 In vivo МР-эксперимент. Визуализация маркера карциномы L
Глава III. Результаты
III. 1. Объем опухоли и объем крови в опухоли. Магнитно-резонансная томография ангиогенеза
111.2 Поправочные коэффициенты по гематокриту в опухолевой и мышечной ткани
111.3 Результаты гистологических исследований (изменения микрососудов в ответ на анти-ангиогенную терапию VEGFR2-TKI)
111.3.1 Гистология препаратов контрольной группы
111.3.2 Гистология препаратов экспериментальной группы (терапия VEGFR2-TKI)
111.4 Характеристика и релаксационные свойства парамагнитного субстрата Gd-DTPA-diSer
111.5 Характеристика биоконъюгатов для специфичной визуализации молекулярных маркеров с помощью парамагнитного субстрата Gd-DTPA-diSer
111.6 In vitro исследования работы системы биоконъюгаты-парамагнитный субстрат
111.7 Визуализация молекулярных мишеней in vivo
Глава 4. Обсуждение результатов и выводы
IV.1 Обсуждение результатов по анализу гемодинамических параметров
IV.2 Обсуждение результатов по визуализации молекулярных маркеров
IV.3 Основные итоги работы
Общее примечание
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Список литературы
Условные обозначения и единицы измерения
Ангиогенезом называют формирование новых сосудов на базе существовавших ранее. Более 25 лет назад Judah Folkman впервые сформулировал основные положения теории взаимосвязи ангиогенеза и онкогенеза [1]: (i) большинство первичных солидных опухолей проходит через стадию небольшой аваскулярной массы (размерами 1-2 мм в диаметре), могущей длительное время находиться в неактивном, «спящем» состоянии. При этом кислород и питательные вещества доставляются в процессе пассивной диффузии; (ii) эти микрообразования каким-то образом могут «включить» ангиогенез, заставляя окружающие сосуды выпускать «ростки» в сторону опухоли, которые впоследствии интегрируются в опухолевую массу. Этим самым новообразование получает возможность роста и метастазирования (через кровоток); (iii) ангиогенный «переключатель» активируется при помощи семейства эндогенных белков, факторов роста; (iv) рост опухоли можно остановить путем блокирования ангиогенеза, либо через «переключатель» либо напрямую разрушая эндотелиальные клетки новых сосудов. Последний подход предполагает, что новообразованные сосуды по своей структуре и клеточному составу отличаются от зрелых «обычных» сосудов; (v) будучи успешным, такой терапевтический подход направлен на лишение раковой опухоли возможности расти и метастазировать; в лучшем случае это может привести к ее регрессу до 1-2 мм в диаметре и достижению «спящей» стадии, когда выживание уже не зависит от наличия кровеносной сети.
В настоящее время анти-ангиогенная терапия является одним из самых перспективных направлений в терапии раковых заболеваний, причем особенно эффективен «двойной удар» -совместно с цитотоксической терапией, направленной против опухолевых клеток. Идут клинические испытания эндогенных ингибиторов ангиогенеза (эндостатин, ангиостатин, тромбоспондин), антител против ключевых ангиогенных факторов (VEGF, интегрины) и низкомолекулярных ингибиторов тирозин-киназной активности их рецепторов (VEGFR2-TKI). Первый анти-VEGF препарат (bevacuzimab, Genentech, Inc., San Francisco, CA) уже одобрен в США для лечения метастатического рака кишечника совместно с химиотерапией, десятки находятся на различных стадиях клинических испытаний.
Особо остро встает вопрос об эффективном мониторинге действия анти-ангиогенных препаратов при клинических испытаниях для определения оптимальной биологически активной дозы и «временного окна» для введения. Пока, несмотря на явные положительные

Для Т2-релаксометрии чаще всего используется последовательность Multi Spin Echo (MSE), более известная в зарубежной литературе как последовательность Carr-Purcell (Карра-Перселла) или ее модификация Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG). Она также встречается под названием Т2шар, поскольку часто используется для создания Т2-карт. Последовательность Carr-Purcell (СР) представляет собой 90°-РЧ импульс, за которым следует цуг повторяющихся 180°-импульсов, создающих соответствующий цуг спин-эхо сигналов. Ее модификация (то есть последовательность CPMG) заключается в применении фазового сдвига во вращающейся системе координат между первым 90°импульсом и последующими 180°-ми, что уменьшает влияние неточностей настройки 180°-импульсов. Другой вариант уменьшения такого накопления ошибок - чередование фаз на 180° градусов в каждой паре 180°-импульсов [104, 107].
II.5 МР-оценка изменения объема крови в опухоли, проницаемости сосудов и прочих параметров методами МРТ
II.5.1 Т1-метод оценки гемодинамических параметров. Описание последовательности SPGR.
Изменение объема крови в опухоли может быть оценено при помощи нескольких фундаментально отличных MPT-техник. Внутрисосудистые Т1-агенты (то есть влияющие, в основном, на продольное время релаксации), позволяют количественно оценивать абсолютный объем крови в опухоли. Агенты, оказывающие влияние на Т2 (спин-спиновую релаксацию) - болюсные хелаты парамагнетиков или суперпарамагнитные наночастицы тоже позволяют измерить Vb по количеству расфазированных протонов. В общем случае, усиление сигнала, вызванное внутрисосудистыми Т1 -агентами, обусловлено объемом крови и водным обменом через стенку сосудов. С другой стороны, уменьшение сигнала, вызванное Т2-агентом, зависит от объема крови и геометрии сосудистой сети (радиус сосудов и так далее). По сравнению с Т2-техникой, использование строго внутрисосудистого Т1-агента при необходимых условиях протонного обмена через стенку сосудов дает информацию об абсолютном объеме крови, которая не зависит от геометрических факторов.
Для оценки гемодинамических параметров применяются последовательности на основе градиентного эха (GRE).