Каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фермента

• Автор: Остапченко, Валерий Геннадиевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Энтеропептидаза - ключевой фермент пищеварения
2.1.1. История открытия и физиологическая роль
2.1.2. Структура энтеропептидазы
2.1.3. Экспрессия гена энтеропептидазы
2.2. Взаимодействия сериновых протеиназ с субстратом при ферментативном катализе
2.2.1. Специфичность сериновых протеиназ
2.2.2. Сайты распознавания субстрата
2.2.3. Распознавание субстратов во время катализа
A. Критерии специфичности сериновых протеиназ
Б. Специфичность определяется этапами связывания и ацилирования
B. Вклад в специфичность ассоциации субстрата
Г. Следствия, касающиеся специфичности гидролиза сложных эфиров
2.2.4. Как удаленные взаимодействия влияют на катализ?
A. Дальние взаимодействия выравнивают субстрат в активном центре
Б. Удаленные взаимодействия оптимизированы в переходном состоянии
B. Удаленные взаимодействия индуцируют конформационные изменения,
содействующие катализу
Г. Удаленные взаимодействия экранируют каталитическую триаду от растворителяЗ 1 Д. Удаленные взаимодействия связывают катализ с движением структуры протеиназы
2.3. Экспрессия рекомбинантных гибридных белков и их ренатурация
2.3.1. Экспрессия рекомбинантных белков
2.3.2. Гибридные (слитные) белки
Проблемы при экспрессии слитных белков
Расщепление слитных белков
Слитные белки с тиоредоксином в качестве белка-носителя
2.3.3. Ренатурация рекомбинантных белков
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты
3.1.2. Штаммы и плазмидные вектора
3.1.3. Питательные среды для роста бактерий
3.1.4. Синтетические олигонуклеотиды
3.2. Методы
3.2.1. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК
3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК
3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля
3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК
3.2.7. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ-32/Ь-НЕР
3.2.7. Олигонуклеотид-направленный мутагенез
3.2.8. Экспрессия гена Ь-НЕР и ее мутантных вариантов
3.2.9. Идентификация белков по Ы-концевой последовательности
3.2.10. Ренатурация гибридных белков с тиоредоксином в качестве белка-носителя
3.2.11. Очистка активной Ь-НЕР и ее мутантных вариантов
3.2.12. Определение количества белка в растворах и гелях
3.2.13. Измерение каталитической активности Ь-НЕР и ее мутантных вариантов
Г идролиз тиоэфира 2-Ьуз-8Вг1
Гидролиз специфического субстрата вОДС-па
Гидролиз неспецифических хромогенных пептидных субстратов
Г идролиз белковых субстратов
Вычисление кинетических параметров
3.2.14. Реакции ингибирования каталитической акитвности Ь-НЕР
3.2.15. Построение пространственных моделей Ь-НЕР и ее мутантных вариантов
3.2.16. Молекулярная динамика каталитических субъединиц энтеропептидаз
3.2.17. Оценка мутантных вариантов Ь-НЕР
3.2.18. Моделирование взаимодействий Ь-ВЕР, Ь-НЕР и ее мутантных вариантов с пептидными субстратами
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Синтез гена Ь-НЕР, его клонирование в плазмидные вектора и подбор экспрессионной системы
4.2. Ренатурация слитного белка Тгх/Ь-НЕР и очистка активного фермента Ь-НЕР
4.3. Исследование ферментативных свойств Ь-НЕР
4.4. Построение пространственной модели Ь-НЕР
4.5. Моделирование и получение мутантных вариантов Ь-НЕР с увеличенным выходом ренатурации
4.6. Исследование специфичности Ь-НЕР
4.7. Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами
4.8. Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов Ь-НЕР с заменами И96К, К219(2 и И96К/К219д
4.9. Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
L-HEP - каталитическая субъединица энтеропептидазы человека L-BEP - каталитическая субъединица энтеропептидазы быка ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
Trx/L-HEP - слитный белок тиоредоксин/каталитическая субъединица энтеропептидазы человека
SDS - додецилсульфат натрия
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан
ПЦР - полимеразная цепная реакция
PIPES - пиперазинсульфоновая кислота
PVDF - поливинилдифторид
STI - соевый ингибитор трипсина
BPTI - бычий панкреатический ингибитор трипсина
Z-Lys-SBzl - тиобензиловый эфир бензилоксикарбонил-Ь-лизина
GD4K-na - Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-р-нафтиламид
DTNB - дитионитробензойная кислота
-pNA - п-нитроанилид
TRAIL - родственный ФНО (фактору некроза опухолей) лиганд, индуцирующий апоптоз
BS А - бычий сывороточный альбумин
СКО - среднеквадратичное отклонение
СКФ - среднеквадратичная флуктуация
IPTG - изопропил-р-тиогалактозид
MALDI - ионизация опосредованная десорбцией вещества с матрицы под действием лазера

50 мМ трис-гидрохлорида (pH 8.0), содержащего 1 мМ хлорида кальция, в течение 2.5 ч при комнатной температуре. За это время происходило полное автокаталитическое расщепление слитного белка Тгх/Ь-НЕР.
При оптимизации этой процедуры порядок этапов не менялся, а варьировались условия на каждом из этапов. Вместе или по отдельности вариьировались следующие параметры:
1) концентрация дитиотреита в буфере для солюбилизации;
2) pH окислитиельного буфера и фолдинг-буфера;
3) концентрация гуанидина в буфере для второго диализа;
4) концентрация и соотношение глутатионов;
5) ионная сила фолдинг-буфера;
6) длительность и температура инкубации на последнем этапе.
При ренатурации мутантных вариантов Ь-НЕР использовалась приведенная выше процедура. Оптимизация их ренатурации не проводилась.
3.2.11. Очистка активной 1_-НЕР и ее мутантных вариантов
Активный фермент был очищен с помощью аффинной хроматографии на агарозе, конъюгированной с соевым ингибитором трипсина (СИТ-агароза). К раствору автокаталитически расщепленного белка добавляли №С1 до конечной концентрации 500 мМ для уменьшения неспецифического связывания примесных белков с СИТ-агарозой. 2 мл СИТ-агарозы уравновешивали буфером, содержащим 10 мМ трис-гидрохлорид (pH 8.0) и 500 мМ ЫаС1. Профильтрованный раствор белка наносили на колонку со смолой со скоростью 1 мл/мин при комнатной температуре. Затем колонку промывали 10 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-гидрохлорид (pH 8.0) и 500 мМ хлорид натрия. Ь-НЕР элюировали буфером, содержащим 75 мМ глицин-гидрохлорид (pH 3.0) и 500 мМ хлорид натрия. Собранные фракции (1 мл) немедленно нейтрализовали, добавляя 50 мкл 2 М трис-