Исследование фибриллогенеза коллагена типа I in vitro

• Автор: Николаева, Тамара Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 105 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Особенности строения молекул коллагена и их свойства, определяющие образование упорядоченных макромолекулярных структур
2.2.Структура коллагеновых фибрилл
2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели
2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл
2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл
2.4. Образование коллагеновых фибрилл in vivo
2.5. Фибриллогенез коллагена in vitro. Факторы и параметры, влияющие на самосборку молекул in vitro: температура, pH, ионная сила, концентрация молекул, компоненты внеклеточного матрикса
2.5.1. Состав ионов
2.5.2. Ионная сила
2.5.3. PH
2.5.4. Температура
2.5.5. Концентрация
2.5.6. Компоненты внеклеточного матрикса
2.5.6.1. Гликозаминогликаны
2.6. Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей
2.7.Методы исследования коллагеновых фибрилл
2.7.1. Метод электронной микроскопии
2.7.2. Метод рентгеновской диффракции
2.7.3. Метод поляризационной микроскопии
2.8. Метод калориметрии
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы и реактивы
3.1.1. Объекты исследования
3.1.2. Реактивы
3.2. Выделение коллагена и очистка
3.2.1. Коллаген из кожи свиней
3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс
3.2.2.1. Коллаген с телопептидами
3.2.2.2. Коллаген без телопептидов
3.3. Методы исследования
3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов
3.3.2. Определение концентрации коллагена
3,3.3.0птические методы
3.3.3.1.Инфракрасная спектроскопия
3.3.3.2. Спектрофотометрия
3.3.3.3. Поляризационно-оптическая микроскопия
3.3.4. Метод сканирующей калориметрии
3.3.5. Методы электронной микроскопии
3.3.5.1. Метод сканирующей электронной микроскопии
3.3.5.2. Метод негативного контрастирования
3.4. Формирование коллагеновых фибрилл
3.4.1. Определение физико-химических характеристик коллагеновых молекул
3.4.2.0птимизация начальных условий фибриллогенеза коллагена
3.4.2.1.Выбор методов образования нативных коллагеновых фибрилл
З.4.2.2. Выбор кинетического режима для самосборки молекул при
температуре 4°С с изменением температуры до 25°С, 30°С, 35°С._
3.4.2.3. Выбор начальных условий образования комплексов коллагена с молекулами внеклеточного матрикса
3.4.3. Поиск условий образования фибрилл: выбор фиксированных
и варьируемых параметров
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Влияние температуры на фибриллогенез коллагена типа I
с удаленными телопептидами
4.2. Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл
4.3. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, при разных значениях температуры и концентрации коллагеновых молекул
4.4. Образование комплексов коллагена с компонентом внеклеточного матрикса хондроитин-4-сульфатом в зависимости от ряда условий__
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

образом, увеличение температуры до 37°С приводит не только к повышению степени упорядоченности фибрилл, но и к гибкой форме фибрилл (Kadler et al., 1990).
Метод электронной микроскопии фиксирует антипараллельную упаковку молекул в фибриллах, сформированных при данных условиях самосборки. Связывание молекул происходит через С-концевые телопептиды, что приводит к существенному изменению радиальной упаковки. Диаметр таких фибрилл превышает диаметр фибрилл in vivo — в 10 раз. Кроме того, было установлено, что в коллагеновых фибриллах изменялось направление суперспиральной упаковки. В отличие от фибрилл in vivo с левосторонней суперспирализацией были сформированы фибриллы с правосторонней суперспиральной упаковкой молекул. По-видимому, система фибриллогенеза in vitro, созданная из молекул проколлагена и фермента проколлаген-С-протеазы даже при температуре 37°С не адекватна физиологической системе самосборки.
Система фибриллогенеза из коллагена типа I с телопептидами была создана при постоянных параметрах состава ионов, ионной силы, концентрации молекул и при варьируемых параметрах pH, температуры (Christiansen et al., 2000). В этой системе фибриллогенеза был установлен поэтапный процесс образования фибрилл из отдельных структурных единиц (субфибрилл) диаметром ~ 4 нм. Связывание фибрилл происходило как в продольном, так и в поперечном направлении фибрилл. При температуре 37°С диаметр фибрилл увеличивался с периодичностью, равной ~ 4 нм. Было установлено, что при повышении pH от 5,0 до 8,5 диаметр фибрилл снижался. При pH 7,5 диаметр фибрилл также снижался с повышением температуры от 25 до 37°С. Диаметр фибрилл коррелировал с низкой устойчивостью к механической нагрузке, а длина фибрилл - с высокой устойчивостью к механической нагрузке. Таким образом, варьрованием pH и температуры можно регулировать размеры фибрилл и их механические свойства. В рассмотренной системе фибриллогенеза in vitro, наиболее приближеннной к условиям in vivo, возможно создание фибрилл с определенными свойствами.