P2Y рецепторы вкусовых клеток. Фармакология и моделирование Ca2+ответов

• Автор: Федоров, Илья Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 83 с. : ил.

1. Обзор литературы
1.1. Организация вкусового анализатора
1.1.1. Устройство периферического вкусового рецепторного органа
1.2. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке
1.2.1. Первичные мессенджеры вкусовой почки
1.2.2. АТР как афферентный вкусовой нейротрансмиттер
1.3. Пуринорецепторы
1.4. Кальций - классический вторичный посредник
1.5. Функциональная роль олигомеризации сигнальных белков
2. Материалы и методы
2.1. Выделение изолированных вкусовых клеток
2.2. Метод микрофотометрии и экспериментальная установка
2.3. Кривые доза-ответ. Достоверность полученных результатов
2.4. Обработка данных и математическое моделирование
3. Результаты и обсуждение
3.1. Эффекты агонистов пуринорецепторов
3.1.1. Ответы на АТР
3.1.2. Ответы на BzATP
3.2. Модель пуринергической кальциевой сигнализации
3.3. Моделирование ответов на нуклеотиды
3.3.1. Проверка модели
3.3.2. Модели мономерных рецепторных единиц
3.3.3. Модели димерных рецепторных единиц
Заключение
Выводы
Список литературы

Наряду со зрением, осязанием, слухом и обонянием, вкус является одним из основных чувств, участвующих в восприятии информации об окружающем нас мире. Вкусовое ощущение зарождается при возбуждении специализированных сенсорных клеток - вкусовых рецепторных клеток - в составе плотных клеточных образований - вкусовых почек. Вкусовые почки формируют периферический вкусовой орган - вкусовые сосочки 5 типов, 3 из которых локализованы на языке - желобоватые, листовидные и грибовидные. Основополагающей функцией хеморецепторных клеток в составе вкусовых почек является распознавание вкусовых веществ, трансдукция и кодирование информации о их концентрации и вкусовой модальности для дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга.
На основе ультраструктурных критериев во вкусовых почках идентифицировано несколько типов клеток: округлые базальные клетки и три типа веретеновидных клеток (типы I, II, III), которые выполняют рецепторную, поддерживающую и/или секреторную функции. Эти клетки обмениваются примерно раз в две недели, развиваясь из базальных клеток и в конце жизни подвергаясь апоптозу. Поскольку вкусовые клетки устанавливают афферентные синапсы со вкусовыми нервами, то их непрерывное обновление требует постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке. Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация также может подвергаться первичной обработке во вкусовой почке. Протекание всех этих гетерогенных, но синхронизированных процессов, несомненно, требует хорошо отлаженных коммуникаций между вкусовыми клетками. Поэтому одной из актуальных задач физиологии периферической вкусовой системы является исследование межклеточных коммуникаций во вкусовой почке.

Исследования, выполненные в нашей лаборатории в последние годы, свидетельствуют о том, что пуринергическая сигнальная система может играть ключевую роль в функционировании вкусовой почки млекопитающих. Так было показано, что в желобоватом и листовидном сосочках субпопуляция вкусовых клеток экспрессирует метаботропные P2Y рецепторы, активация которых приводит к мобилизации внутриклеточного Са2+ (Kim et al., 2000; Baryshnikov et al., 2003; Bystrova et al., 2006). Было также установлено, что вкусовые клетки типа II секретируют АТР в ответ на их стимуляцию (Romanov et al., 2007) и что мишенью нуклеотида являются клетки типа III (Romanov et al., в печати). Кроме того, Фингером с соавторами (Finger et al., 2005) недавно было показано, что генетический нокаут ионотропных Р2Х2/Р2Хз рецепторов, которые функционируют в афферентном вкусовом нерве, приводит к полному подавлению вкусовой чувствительности у генетически модифицированных животных. Это является убедительным аргументом в пользу того, что АТР выполняет функцию афферентного нейротрансмиттера в акте вкусовой трансдукции.
Перечисленные выше факты свидетельствуют о том, что внеклеточный АТР является основной сигнальной молекулой во вкусовой почке, которая вовлечена как в передачу вкусовой информации, так и в паракринную регуляцию. В свете изложенного, нам представлялось важным детально исследовать Са сигнализацию во вкусовых клетках при участи P2Y рецепторов. Прежде всего мы попытались охарактеризовать фармакологический профиль пуринорецепторов, функционально экспрессируемых во вкусовых клетках, используя определенный набор P2Y
л I
агонистов и антагонистов и регистрируя Са ответы. В результате проделанной работы были получены кривые доза-ответ, которые было невозможно объяснить в своей совокупности, опираясь на представленные в литературе фармакологические свойства рекомбинантных P2Y рецепторов. В поисках объяснения данного противоречия, мы предположили, что в экспрессионной системе P2Y рецепторы функционируют преимущественно в

достигают фактического равновесия до момента пика Са2+. Это позволяет определять их концентрацию используя равновесную аппроксимацию.
Поскольку обратный агонизм не был установлен для P2Y рецепторов, мы также постулировали, что активность этих рецепторов в покое пренебрежимо мала, и использовали следующую кинетическую схему для описания связывания агониста с рецептором и последующей активации G-белков и их деактивации: А + R <-» AR*; AR* + G +-» AR*G —> AR* + G* и G* —> G, где R, AR*, G и G* обозначают активный и неактивный рецептор и G-белок, соответственно. Для данной схемы фракция мономерных рецепторов, связанных с агонистом А в присутствии конкурентного антагониста /, может быть записана как:
Рк=[А11*У[11т} = ([АУК)/{+[1УК,+[АУК) (21)
где [Л] и [.AR*] - общая концентрация рецепторов и концентрация рецепторов, связанных с агонистом, то есть активированных, [А] и [/] -концентрации агониста и антагониста, К и R*j - константы диссоциации для связывания агониста и антагониста, соответственно. Поскольку в стационарном состоянии [G*] = [G][AR*]/Kg, где кажущаяся константа диссоциации Кс является комбинацией микроскопических констант скоростей, фракция активированных G-белков записывается как:
Fc = [G*]/[Gr] = ([AR*]/KG)/( 1 + [AR*VKg) = SFr /(1 + 5FR) (22)
где GT - общая концентрация G-белков и 5 = [RT/KG.
Приведенная выше диаграмма является упрощенной аппроксимацией взаимодействий в системе агонист-рецептор-О-белок и сопряженных
процессов внутриклеточной сигнализации. В то же время, при избытке G-белка (то есть, когда [Gr]»[All*]) и при незначительной конститутивной активности рецепторов разнообразные модели, включая СТС (cubic ternary complex) модель (Kenakin, 2004), предсказывают, что концентрация тройного комплекса AR*G и, соответственно, концентрация активированных G-белков описывается простой изотермой Ленгмюра, т.е. уравнением типа (22). В этой связи, предлагаемая нами упрощенная аппроксимация может быть
применима фактически к более сложным кинетическим схемам, которые