Органофосфатгидролаза: получение генетически-модифицированных аналогов и анализ каталитических характеристик

• Автор: Вотчицева, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 164 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ФОС — фосфороорганические соединения ОРН - органофосфатгидролаза ДФФ - диизопропилфторфосфат БОВ - боевые отравляющие вещества ПДК - предельно допустимая концентрация
OPH-His6- органофосфатгидролаза, содержащая гексагистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка
His6-OPH - органофосфатгидролаза, содержащая гексагистидиновую последовательность
на N-конце молекулы белка
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Е. coli DH5a/pTES-OPH - клетки Е. coli DH5a, трансформированные плазмидой pTES-ОРН
Е. coli W3110/pTES-OPH- клетки Е. coli W3110, трансформированные плазмидой pTES-ОРН
F-Tyr - 3-фтортирозин
F-Tyr-His6-OPH - Hise-OPH, содержащая в структуре белка F-Tyr CBD - целлюлозосвязывающий домен GST - глутатион-Б-трансфераза
SjGST - глутатион-Б-трансфераза из клеток Schistosoma japonicum
GFP - зеленый флюоресцирующий белок
ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактопиранозид
IMAC — иммобилизационная металл-хелатирующая хроматография
NTA — нитрилотриуксуская кислота
КМА - карбоксиметиласпартат
IDA - иминодиуксусная кислота
TED - ^КДР-трис(карбоксимстил)этилеидиамин
ПВС — поливиниловый спирт
криоПААГ - полиакриламидный криогель
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
SDS - додецилсульфат натрия
CHES - 2-[Ы-циклогексиламино]этансульфоновая кислота TRIS - Трис[гидроксиметил]аминометан OD - оптическая плотность ФО - фосфорорганический
Зарин - фторангидрид изопропилового эфира метилфосфоновой кислоты
ЛУ-Х - 8-2-диэтиламиноэтиловый, О-изобутиловый эфир метилтиофосфоновой кислоты
УХ - 8-2-диизопропиламиноэтиловый, О-этиловый эфир метилтиофосфоновой кислоты
Деметон - 8 - О,О-диэтил 8-2-этилтиоэтил фосфотиоат
ЭСКП — энергия стабилизации кристаллическим полем
БНРЛ - дегидрофолатредуктаза
ИЭФ - изоэлектрофокусирование
КЧ - координационное число
ЗОБ-РЛСЕ электрофорез - электрофорез в денатурирующих условиях
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ф 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ферменты, катализирующие гидролиз ФОС
1.2. Органофосфатгидролаза
1.2.1. Кинетические характеристики и субстратная специфичность ОРН
1.2.2. Структура активного центра и механизм действия ОРН
1.3. Экспрессия гена, кодирующего синтез ОРН в различных биологических объектах
1.4. Факторы, обуславливающие высокоэффективную экспрессию генов в клетках Е. coli
1.4.1. Конфигурация эффективного экспрессионного вектора
1.4.2. Направленная локализация синтеза белков
ф 1.4.3. Молекулярные шапероны и протеолиз
1.4.4. Условия культивирования
1.5. Гибридные белки, выделение и их свойства
^ 1.5.1. Полигистидинсодержащие белки и генетические конструкции для их получения

1.5.2. Носители для выделения Шяб-содержащих белков
1.5.3. ОРН в составе гибридных белков
1.6. Комплексообразование металлов с остатками гистидина в белках
1.7. Белки, содержащие неприродные аминокислоты в структуре молекулы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы и приборы
2.1.1. Реактивы
ф 2.1.2. Ферменты
2.1.3. Бактериальные штаммы
2.1.4. Питательные среды
2.1.5. Составы растворов
2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды
2.1.7. Приборы
2.2. Методы
2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой
ф ОРН

клетках E. coli BL21 проводилась с помощью ИПТГ. Уровень экспрессии модифицированной ОРН оказался ниже нативного и составил 1,4 мг/л против 11,1 мг/л, несмотря на то, что для модифицированной ОРН доля растворимой фракции фермента выше, чем для немодифицированной ОРН.
Было показано, что введение в среду 2 мМ хлорида кобальта в процессе роста клеток приводит так же, как и в случае нативной ОРН, к существенному увеличению активности фермента [188].
С целью увеличения уровня экспрессии ОРН сконструировали белок, в котором GFP был соединен с двумя копиями ОРН таким образом, что последовательность структурных элементов в таком гибридном белке может быть записана следующим образом: GFP-OPH-OPH [71]. В результате наблюдался более высокий выход ОРН по сравнению с аналогичной конструкцией, кодирующей синтез одной копии фермента.
Создание еще более сложных конструкций гибридных белков, содержащих одновременно, например, Швб-гистидиновую последовательность, GFP, энтерокиназу и ОРН [187], вероятно, нельзя считать целесообразным с точки зрения упрощения процедуры очистки основного белка и контроля над этим процессом. Наряду с уникальностью всех полученных белковых конструкций, содержащих ОРН, в целом следует отметить крайне низкие уровни экспрессии гибридных белков даже после оптимизации их структур и условий экспрессии. Количество таких белков составляло не более 0,1 % от массы всех синтезируемых белков в клетке.
Было показано, что в связке с GFP активность ОРН сохраняется и флюоресценция GFP ей пропорциональна. Преимущество такого подхода к детекции ОРН в том, что флюоресценция дает возможность детекции очень малых количеств фермента, а также после исследования показали, что GFP-метку можно легко отделить от ОРН, при этом активность ОРН полностью восстанавливается.
Как видно из приведенных данных, в состав гибридных белков, содержащих ОРН, вводили различные гибридные партнеры для целей визуализации и мониторинга процесса выделения, а также для целей иммобилизации полученных гибридных белков. Высокоэффективных систем синтеза ОРН, содержащей Шяб-последовательность к настоящему моменту не существует, в связи с чем, разработка таких систем является перспективной и актуальной для получения высоких выходов гибридных белков, содержащих в своем составе ОРН и Швб-последвательность, наличие которой может существенно упростить процесс выделения такого белка.