Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha

• Автор: Малявко, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Список сокращений
1. Введение
2. Обзор литературы. Регуляция длины теломер
2.1. Регуляция длины теломер почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica)
2.1.1. Строение теломер
2.1.2. Теломераза почкующихся дрожжей
2.1.3. Регуляция длины теломер Saccharomyces cerevisiae
2.1.4. Регуляция длины теломер других почкующихся дрожжей
2.2. Регуляция длины теломер делящихся дрожжей (Schizosaccharomyces pombe)
2.2.1. Строение теломер
2.2.2. Теломераза S. pombe
2.2.3. Регуляция длины теломер S. pombe
2.3. Регуляция длины теломер человека (Homo sapiens)
2.3.1. Строение теломер человека
2.3.2. Теломераза человека
2.3.3. Регуляция теломеразы на теломерах
2.4. Заключение
3. Результаты и обсуждение
3.1. Постановка задачи
3.2. Обратная транскрипция А
3.2.1. Детекция дополнительного dT на теломерах in vivo
3.2.2. Влияние мутаций нуклеотида А170 HpTER на длину теломер
3.2.3. Обратная транскрипция А170, как способ контроля длины теломер
3.3. Регуляция длины теломер H. polymorpha. Теломерные белки
3.4. Заключение

4. Материалы и методы
4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы
4.2. Методики, использованные в работе
4.2.1. Базовые методики работы с ДНК и клетками, клонирование
4.2.2. Определение последовательностей теломер Н. ро1утогрка
4.2.3. Получение штаммов, экспрессирующих мутантные формы НрТЕЯ
4.2.4. Саузерн блот анализ концевых рестрикционных фрагментов
4.2.5. Получение штаммов Яар1А-АС-НА и Яар1В-НА
4.2.6. Получение «нокаутных» штаммов
4.2.7. Иммунопреципитация хроматина
5. Выводы
6. Список литературы

Список сокращений
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота TR - теломеразная РНК
TERT - теломеразная обратная транскриптаза
RPA - Replication Protein А
СЫР - иммунопреципитация хроматина
оцДНК - одноцепочечная ДНК
дцД НК - двуцепочечная ДНК
TRD - быстрое удаление теломеры
мяоРНК - малая ядрышковая РНК
ПЦР - полимеразная цепная реакция
нт - нуклеотид
пн - пара нуклеотидов
тпн — тысяча пар нуклеотидов
НА - гемагтлютинин
НА-таг - гемагглютининовый таг
НА-агароза - агароза, ковалентно модифицированная антителами к гемагтлютинину WT — дикий тип
Tris — трис(гидроксиметил)аминометан ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия ДСН - додецилсульфат натрия ДТТ - 1,4-дитио-ОЬ-треитол ПМСФ - фенилметилсульфонилфторид БСА - бычий сывороточный альбумин dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфаты ДМСО - диметилсульфоксид PEG4000 - полиэтиленгликоль 4
ScRapl - Rapl из Saccharomyces cerevisiae. Аналогично для других белков и других видов дрожжей, например, KlRifl — Rifl из Kluyveromyces lactis. mRapl - Rapl мыши, hRapl -Rapl человека. Аналогично для других белков мыши и человека.

длинные теломеры/ много шелтерина
короткие теломеры/ мало шелтерина

закрытое" состояние

открытое" состояние
- шелтерин
-теломераза
Рисунок 2.16. Модель регуляции длины теломер человека шелтериновым комплексом
Однако, РОТ1 также оказывает положительное влияние на теломеры. Суперэкспрессия РОТ1 приводит к удлинению теломер [152]. Вдобавок, in vitro POTI блокирует теломеразную активность только на некоторых субстратах. При связывании РОТ1 с олигонуклеотидом так, что хотя бы восемь нуклеотидов с 3’-конца остаются свободными, активность и процессивность теломеразы даже увеличиваются [153]. Более того, дальнейшее увеличение активности в этом случае происходит при дополнительном добавлении белка ТРР1 [154]. Эти результаты говорят о возможности более сложного влияния шелтеринового комплекса на работу теломеразы in vivo. Предполагают наличие дополнительного фактора и/или посттрансляционной модификации, которые могли бы переключать РОТ1/ТРР1 из ингибирующего состояния в активирующее [154].
Ключевым моментом в предложенной модели регуляции теломеразы человека белками шелтеринового комплекса является контроль активности (процессивности) теломеразы. Однако, в рассмотренных ранее аналогичных моделях дрожжей ингибирующее действие теломерных белков было скорее направлено на привлечение теломеразы на теломеры. Каким же образом происходит доставка теломеразного комплекса на теломеры человека? Оказывается, взаимодействие между N-концевым OB-fold доменом ТРР1 и N-концевым доменом hTERT, необходимое для активации теломеразы, также важно для взаимодействия теломеразы с теломерами [155, 156]. Удаление N-концевого домена ТРР1 приводит к укорочению теломер, в отличие от фенотипа нокдауна полноразмерного ТРР1. Этот факт добавляет сложности в механизм контроля теломеразы шелтерином. Более того,
[132].