Структурно-функциональное исследование искусственного биокатализатора, полученного на основе антиидиотипического антитела

• Автор: Смирнов, Иван Витальевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

Обзор литературы
Индуцированные абзимы
Природные каталитические антитела
Антиидиотинические антитела
Результаты и обсуждение
Исследование каталитической активности антиидиотипического антитела
6В8-Е12
Клонирование генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и
6В8-Е12
Создание генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела
6В8-Е12 в виде одноцепочечного антитела
Исследование каталитических свойств полученного одноцепочечного антитела
Материалы и реактивы
Стоковые растворы
Методы
Работа с нуклеиновыми кислотами Г.'
Методы работы с бактериями Escherichia coli
Работа с белками
Выводы
Список литературы
Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем осуществляются при участии ферментов. В последние десятилетия прошлого века исследователям удалось с помощью методов генетической инженерии и направленной химической модификации удалось создать ферменты с измененной субстратной специфичностью. В ряду каталитических активных молекул особенное место занимают рибозимы -каталитические молекулы РНК и абзимы - каталитические антитела.
Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и в основном ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.
Весьма интересным было бы получить абзим, способный разрушать белки патогенов. В этой связи крайне важной является задача создания каталитического антитела с протеолитической функцией. Эта задача оказывается практически невыполнимой с помощью подхода с использованием аналогов переходных состояний в качестве исходных гаптенов. Антительная матрица, специфически связывающаяся со структурой, мимикрирующей тетраэдр, эффективна в качестве биокатализатора эстеролиза, но не способна осуществить более сложные превращения, требующие эффективных конформационных подстроек в комплексе биокатализатор - белковый субстрат.
Существует три основных подхода к созданию протеолитических абзимов:
1) реакционная иммунизация

2) индукция протеолитических антител на фоне
индуцируемого аутоиммунного заболевания
3) получение антиидиотипических антител, как антител
внутреннего образа на ферменты, катализирующие реакцию
протеолиза.
Метод получения антиидиотипических антител опирается на свойства иммунной системы образовывать антитела “внутреннего* образа” и на
идиотипическую гипотезу, высказанную в 1974 году Н. Ерни [1]. Первым
. 1
удачным примером абзима, полученного данным методом, является моноклональное антитело 9А8, связывающее моноклональное антитело АЕ2, которое в свою очередь связывает активный центр ацетилхолинэстеразы. Было показано, что антитело 9А8 проявляет свойства исходного антигена, то есть обладает ацетилхолинэстеразной активностью [2].
Данная диссертационная работа посвящена проблеме структурнофункционального исследования антиидиотипического антитела 6В8Е12, полученного к участку активного центра эндопротеиназы субтилизин Карлсберг.
Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. А конструирование на их основе «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению «лекарств будущего».

Ингибитор Максимальное ингибирование, % Константа ингибирования, нМ
9А8 НЕ АсЬЕ 9А8 НЕ АсЬЕ
Эзерин 90 100 17,95 16,7
Пиридостигмин 83 100 15,7
Неостигмин 85 98,5 3,2 4,9
Таб. 6 Ингибирование гидролиза ацетилтиохолина карбаматами. Начальная скорость получена при концентрациях антитела 9Л8 и ацетилхолинэстеразы НЕ АсЬЕ.
Константы ингибирования фермента и абзима близки для эзерина (17
нМ) и неостигмина (4 нМ). В случае же пиридостигмина К„ различаются в
раз. Таким образом, стадия образования ацил-фермента в случае катализа
антителом 9А8 и ацетилхолинэстеразой имеет сходные черты.
Клонирование и секвенирование вариабельных доменов цепей антитела
9А8 [131] позволило существенно уточнить представления о его
каталитических и структурных свойствах [132]. Антитело 9А8, так же как и
бутирилхолинэстераза, инактивировалось механизм-зависимыми
ингибиторами кумаринил-этил-п-трифтороацетамидофенил
метилфосфонатом (I) и и-нитрофенил-метил л-биотинамидофенил
метилфосфонатом (II) и, по данным иммуноблоттинга, тяжелая цепь антитела
образовывала ковалентный комплекс с ингибитором II. Массспектрометрический анализ трипсинового гидролизата антитела 9А8,
обработанного ингибитором II, показал наличие ковалентной модификации
пептидного фрагмента, соответствующего СОЮ тяжелой цепи и участку
каркасной области. При сравнении 9А8 с контрольным антителом, не
образующим ковалентного комплекса с ингибитором II и проведении
компьютерного моделирования пространственной структуры вариабельных
доменов 9А8 было установлено, что единственным возможным
реакционноспособным аминокислотным остатком является 8ег99,
находящийся в корректной ориентации и на достаточно небольшом
расстоянии от остатка Н1б35 тяжелой цепи.