Выделение и структурно-функциональная характеристика трипсина камчатского краба (Paralithodes camtschaticus)

• Автор: Кислицын, Юрий Алексеевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ТРИПСИНЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
1. Классификация трипсинов
2. Современные подходы к выделению трипсиноподобных протеиназ
2.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография и скоростная жидкостная хроматография белков
2.2. Аффинная хроматография
2.3. Нестандартные подходы к очистке трипсинов
3. Молекулярные свойства трипсинов беспозвоночных
3.1. Физико-химические свойства
3.1. 1. Молекулярные массы, изоэлектрические точки
3.1.2. Аминокислотный состав
3.2. Энзиматические свойства
3.2.1. pH -стабильность и pH оптимумы активности
3.2.2. Субстратная специфичность
3.2.2.1. Синтетические субстраты
3.2.2.2. Полипептидные и белковые субстраты
3.3. Ингибиторы трипсинов
3.3.1. Синтетические ингибиторы
3.3.2. Природные ингибиторы
4. Структурные детерминанты, определяющие каталитические свойства и специфичность трипсинов
4.1. Активный центр
4.1.1. Каталитическая триада
4.1.2. Оксианионная впадина
4.2. Субстратсвязывающие участки
4.2.1. Б1 - связывающий участок
4.2.2. Полипептидсвязывающий участок
5. Современные представления о механизме катализа сериновыми протеиназами
6. Первичная структура трипсинов беспозвоночных
6.1. Сигнальные и активационные пептиды
6.2. Аминокислотные последовательности зрелых трипсинов
7. Пространственная структура и эволюция трипсинов
8. Биологические функции трипсинов беспозвоночных
8.1. Процессы пищеварения
8.2. Процессы свертывания гемолимфы
8.3. Синтез пептидных антибиотиков
8.4. Процесс полимеризации меланина
II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Выделение трипсина РС
2. Критерии чистоты и молекулярные свойства трипсина РС
3. Стабильность трипсина РС
4. У-концевая последовательность трипсина РС
5. Аминокислотный состав
6. Субстратная специфичность трипсина РС
6.1. Гидролиз хромогенных пептидных субстратов
6.2. Гидролиз Вг-Агд-рМА трипсином РС при различных
температурах
7. Ингибирование трипсина РС
8. Первичная структура трипсина РС
8.1. Сигнальные и активационные пептиды трипсина РС
8.2. Аминокислотная последовательность зрелого трипсина РС
8.2.1. Консервативные аминокислотные остатки трипсина РС и
других трипсинов
8.2.2.1. Дисульфидные связи
8.2.2.2. Кальций-связывающий участок
8.2.2.3. Участки автолиза

8.2.2.4. Другие каталитически или структурно важные остатки
8.2.2.5. Петельные структуры трипсинов
8.2.3. Сравнение первичной структуры трипсина РС с первичными
структурами трипсинов психрофильных рыб и первичной
структурой трипсина быка
9. Эволюционное положение трипсина РС
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
1.1. Реактивы
1.2. Субстраты
1.3. Белковые ингибиторы
1.4. Белки
2. Методы
2.1. Очистка трипсина РС (первая схема)
2.1.1. Ионообменная хроматография на аминосилохроме
2.1.2 Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе
2.1.3 Аффинная хроматография на аргинин-агарозе
2.2. Очистка трипсина РС (вторая схема)
2.1.1 Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе
2.1.2. Аффинная хроматография на ПТГ-агарозе
2.1.3. Ионообменная хроматография на колонке Mono О в режиме
FPLC
2.3. Концентрирование и обессоливание белковых растворов
2.4. Определение активности фермента по я-нитроанилидному субстрату
2.5. Определение концентрации белка
2.6. Определение молекулярной массы фермента
2.6.1. Гель-электрофорез
2.6.2. Масс-спектрометрический анализ
2.7. Определение У-концевой последовательности белка
диполей друг относительно друга. В ферментах диполи активного центра, ассоциированные с полярными группами, молекулами воды и ионизованными остатками уже частично ориентированы для благоприятного взаимодействия с зарядами тетраэдрического переходного состояния. Таким образом, сеть молекул воды должна перестроиться (затратив энергию) для того, чтобы образовать водородные связи с заряженным тетраэдрическим интермедиатом. В ферментах водородные связи уже частично ориентированы к зарядам тетраэдрического переходного состояния [115].
В научной литературе можно найти две другие гипотезы, объясняющие эффективное действие сериновых протеиназ. Первая гипотеза ведет свое происхождение от работ, посвященных исследованию механизма сериновых протеиназ с применением методов ЯМР [116] и предполагает образование аномальной водородной связи между OSl-Aspl02 и N51-His57, которая отличается от обычной водородной связи рядом свойств. Данную связь в англоязычной литературе обозначают, как LBHB (от английского “low-barrier hydrogen bond”) кроме того, эту связь иногда называют “каталитической” а в русскоязычной литературе- низкобарьерная водородная связь [117]. LBHB-связи характеризуются: более короткой дистанцией между гетероатомами (<2,65 А) и некоторыми другими особенностями. Образование данной связи подразумевает частичное смещение протона от His 57 к Aspl02. Протон как бы находится на равноудаленном расстоянии от обоих аминокислотных остатков и требует для своего смещения меньшую энергию, чем в случае обычной водородной связи [118]. Такое положение протона напоминает теорию переноса зарядов, предложенную Блоу [119]. Согласно теории LBHB, связывание субстрата создает определенное давление в активном центре фермента, вследствие чего изменяется взаимодействие между His57 и Asp 102, что облегчает возникновение LBHB между этими двумя каталитически важными остатками активного центра. В результате образования LBHB увеличивается