Обнаружение стероидов экзогенной природы, выделенных из мочи человека, методом изотопной хромато-масс-спектрометрии

• Автор: Прасолов, Илья Сергеевич
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 166 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1 1 Теоретические основы метода изотопной хромато-масс-спектрометрии
1 2 Основные функциональные узлы изотопного хромато-масс-спектрометра
13 Метаболизм стероидных гормонов
131 Особенности биосинтеза стероидов в организме человека
1 3 2 Способы интерпретации результатов анализа
133 Синтетические аналоги эндогенных стероидов
13 3 1 Тестостерон
13 3 2 Эпитестостерон
1 3 3 3 Дигидротестостерон
1 3 3 4 Андростендион
1 3 3 5 Дегидроэпиандростерон
1 3 3 6 Прегненолон
13 3 7 Форместан
1 3 3 8 Болдион и болденон
14 Подготовка образцов к анализу
1 4 1 Использование реактива Жнрара
1 4 2 Иммуноаффинная хроматография
1 4 3 Фракционирование с помощью тонкослойной хроматографии
1 4 4 Твердофазная экстракция
1 4 5 Фракционирование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Глава 2. Экспериментальная часть
2 1 Исходные вещества и материалы
2 2 Основное оборудование
2 3 Вспомогательное оборудование
2 4 Методика эксперимента
2 4 1 Приготовление растворов определяемых соединений и буферов
2 4 2 Твердофазная и жидкостно-жидкостная экстракция
2 4 3 Фракционирование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2 4 4 Дериватизация
2 4 5 Взаимодействие с реактивом Жирара
2 46 Газохроматографическое определение стероидов
2 4 7 Масс-спектрометрическая идентификация стероидов
2 4 8 Условия окислительной конверсии стероидов

2.4.9. Масс-спектрометрическое определение продукта конверсии
2.9.10. Пробоподготовка прогормональных препаратов
2.4.11. Подготовка образцов мочи к анализу
Глава 3. Пробоподготовка образцов мочи
3.1. Подбор условий жидкостно-жидкостной и твердофазной экстракции
3.2. Выбор условий разделения методом жидкостной хроматографии
3.3. Использование реактива Жирара
3.4. Дериватизация
Глава 4. Инструментальный анализ экстрактов
4.1. Выбор условий газохроматографического разделения
4.2. Масс-спектрометрическая идентификация целевых соединений
4.3. Подбор условий окислительной конверсии стероидов и масс-спектрометрической идентификации продукта конверсии
Глава 5. Валидация и аттестация разработанной методики
5.1. Метрологические характеристики разработанной методики
5.2. Внутрилабораторные критерии экзогенной природы стероидов
5.3. Межлабораторное сравнение результатов анализа
Глава 6. Изменение изотопного состава эндогенных стероидов после употребления их синтетических аналогов
6.1. Выделение и анализ активных компонентов прогормональных препаратов
6.2. Препарат№1 - тестостерон
6.3. Препарат №2 - дегидроэпиандростерон
6.4. Препарат №3 - прегненолон
6.5. Препарат №4 - болдион
6.6. Препарат №5 - 5а-андростан-3(3,17р-диол
6.7. Препарат №6 - 1-андростен-Зр,17р-диол
Заключение
Выводы
Список сокращений
Список литературы

Введение
Актуальность темы. В настоящее время в практике допинг-контроля существует необходимость выявления случаев употребления допинговых препаратов, являющихся близкими аналогами гормонов, вырабатываемых в организме человека, или их метаболическими предшественниками: тестостерона, дегидроэпиандростерона,
андростендиона, андростендиолов. По результатам анализа методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией это сделать не удается, и отмечаются лишь так называемые атипические изменения гормонального профиля спортсмена.
Применение синтетического тестостерона в спорте запрещено на протяжении 35 лет. Ранее единственным способом установить факт его использования было определение отношения концентраций тестостерона (71) и его неактивного изомера - эпитестостерона (/•’) в моче. Однако данный подход имеет ряд существенных ограничений, поскольку отношение Т Е в популяции варьируется в довольно широких пределах (от 0.1 до 4.0 и выше). Кроме этого, в последнее время на рынке спортивного питания широкое распространение получили «прогормоны» - вещества, которые являются предшественниками или метаболитами тестостерона и не определяются традиционными методами допинг-контроля. Установить происхождение стероидных гормонов можно двумя способами - обладая информацией о стероидном профиле спортсмена или напрямую, посредством изотопной хромато-масс-спектрометрии. Исследование стероидного профиля по программе “Биологический паспорт спортсмена” представляет собой косвенный подход к решению проблемы и ввиду отсутствия специфических метаболитов («маркеров») требует наличия большого количества статистических данных и их последующей индивидуализации. Поскольку подавляющее большинство синтетических стероидов получают из растительного сырья с изотопным составом углерода около минус 30%о и ниже (относительно международного стандарта белемнита), факт их применения может быть выявлен с использованием изотопной масс-спектрометрии. Метод основан на измерении отношения изотопов 1ЛС/12С эндогенных стероидов в организме человека, которое в естественных условиях лежит в диапазоне от минус 17 до минус 26%о в зависимости от места проживания и особенностей диеты человека, и никогда не достигает значений ниже минус 27%о.

Рисунок 17 — Изотопный состав экскретируемого с мочой ЛІ ЭА у 5 добровольцев после приема 50 мг экзогенного ДІ'ЗА [23]
1.3.3.6. Прегненолон
Прегненолон (рисунок 18) является важным звеном в процессе синтеза андрогенов и кортикостероидов из холестерина [59].
Рисунок 18 — Структурная формула прегненолона
После того, как прегненолон стал коммерчески доступным в сороковых годах двадцатого века, были проведены исследования, подтвердившие его эффективность в качестве общеукрепляющего средства [60.61]. Однако статую этих исследований до сих пор неоднозначен, и благоприятные эффекты приёма прегненолона на данный момент не имеют всеобщего признания [62].
Поскольку употребление прегненолона не вызывает улучшения спортивных показателей, он не относится к допинговым средствам и не фиту'рирует в