Исследование предельных возможностей лазерной сканирующей микроскопии при наблюдении сильно рассеивающих флуоресцирующих объектов

• Автор: Катичев, Алексей Ростиславович
• Шифр специальности: 01.04.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Содержание
Введение
Глава 1. Лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия как метод визуализации структуры биотканей
1.1. Оптические методы визуализации структур биотканей
1.2. Метод лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии
1.3. Флуорофоры для систем ЛСФМ. Проблема выбора флуорофоров для систем
двухфотонной микроскопии
1.4. Проблема описания распространения излучения в рассеивающих средах
Глава 2. Численное моделирование изображений лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии (ЛСФМ)
2.1. Общие формулы, описывающие изображения в системах конфокальной и
двухфотонной ЛСФМ в нерассеивающей среде
2.2. Разработка алгоритма компьютерного моделирования изображений ЛСФМ в
рассеивающей среде на основе численного метода Монте-Карло
2.3. Ускорение расчетов с помощью графических процессоров
2.4. Основные выводы
Глава 3. Монте-Карло моделирование изображений биоткани, сформированных методом конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии
3.1. Проблема предельной глубины визуализации в кЛСФМ
3.2. Пространственное распределение флуоресценции, возбуждаемой в результате
линейного поглощения излучения накачки в сильно рассеивающей среде
3.3. Собирающая способность системы кЛСФМ в рассеивающей среде
3.4. Предельная глубина визуализации структуры биотканей для систем кЛСФМ
3.5. Моделирование изображений рассеивающих сред с неоднородным
распределением флуорофора. Экспериментальная проверка максимально достижимой глубины визуализации биологических тканей
3.6. Основные выводы
Глава 4. Монте-Карло моделирование изображений биоткани, сформированных методом двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии
4.1. Особенности моделирования эффективной функции рассеяния точки установок
двухфотонной микроскопии
4.2. Распределение мощности двухфотонно возбуждаемой флуоресценции в
рассеивающей среде с однородным распределением флуорофоров
4.3. Определение предельной глубины наблюдения дфЛСФМ в рассеивающих средах
4.4. Моделирование изображений рассеивающих сред с неоднородным
распределением флуорофоров
4.5. Основные выводы
Глава 5. Использование коллоидных квантовых точек в качестве флуорофоров для повышения глубины визуализации в системах двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии
5.1. Структура и флуоресцентные свойства квантовых точек
5.2. Описание эффекта насыщения флуоресценции квантовых точек при
двухфотонном поглощении

5.3. Влияние эффекта насыщения на пространственное разрешение изображений структуры биотканей в системах дфЛСФМ
5.4. Основные выводы
Заключение
Литература
Список работ по диссертации

Введение
Разработка и развитие методов неинвазивной визуализации внутренних структур биологических объектов является одной из приоритетных физических задач. Изучение структуры биотканей на микроскопическом уровне дает возможность исследовать принципы и механизмы функционирования живых организмов. Область применения данных методов достаточно широка и включает такие актуальные направления, как эмбриология, нейробиология, онкология, биоэлектрогенез растений и многие другие. В частности, нейробиология изучает механизмы формирования и обучения сложных нейрональных структур мозга млекопитающих как на срезах тканей мозга, так и на лабораторных животных. В эмбриологии важной задачей исследования является мониторинг процессов формирования живых организмов на клеточном уровне. Изучение механизмов генерации электрических сигналов у высших растений, играющих важную роль в процессе передачи информации и регуляции, является одной из фундаментальных задач современной биофизики и осуществляется с помощью систем имиджинга с клеточным разрешением. В онкологии актуальной задачей является анализ процессов проникновения и распространения новообразований в здоровую ткань. Для проведения такого рода исследований необходим метод, позволяющий осуществлять неинвазивный имиджинг структур биотканей. Основными требованиями при этом являются возможность получения изображений с различных слоев с высокой селекцией по глубине и клеточным пространственным разрешением. Среди современных методов анализа вышеуказанным требованиям соответствуют методы конфокальной и двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии. Данные методы базируются на принципах флуорес- Д, цеитного анализа и заключаются в регистрации сигнала флуоресценции, возбуждаемой в объекте исследования с помощью лазерных остросфокусированных пучков.
В слабо рассеивающих средах разрешающая способность методов лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии (ЛСФМ) находится на уровне дифракционного предела и достигает 200 нм, что позволяет получать изображения структур биотканей на уровне отдельных органелл с глубин вплоть до нескольких миллиметров. Однако, ЗБ визуализация внутренней структуры сильно рассеивающих образцов биотканей методами ЛСФМ с сохранением высокого пространственного разрешения существенно ограничено. Выявление конкретных физических причин, лежащих в основе этих ограничений, а также определение рабочего диапазона глубин, в пределах которого возможно получение изображений с высоким разрешением, остаются актуальными проблемами оптики.
Известно, что многократное рассеяние вызывает изменение пространственного распределения флуоресценции и ухудшает условия детектирования полезного сигнала.

лазер, излучающий в ближнем ИК-диапазоне (700-1000 нм) на центральной длине волны Яех. В современных фемтосекундных лазерах, используемых в микроскопии, длительность импульса Т составляет около 100 фс, частота следования импульсов F - десятки мегагерц (до 108 Гц). Вторая особенность дфЛСФМ - отсутствие конфокальной диафрагмы, так что сигнал флуоресценции собирается со всей плоскости изображения.
Для описания изображений в системах дфЛСФМ можно воспользоваться соотношением (2.11), где в первом интеграле будет фигурировать плотность мощности флуоресценции, которая генерируется в образце в единицу времени за счет двухфотонного поглощения излучения накачки. Второй интеграл, определяющий эффективность детектирования фотонов флуоресценции из заданной точки, в отсутствие ограничивающей конфокальной диафрагмы оказывается равным единице. Таким образом, изображение в дфЛСФМ можно описывать формулой:
Kr/) = Keem Jnem(r,rf)d3r, (2.12)
объект
где пет — число фотонов флуоресценции, возникающих в объекте в результате двухфотонного поглощения, а еет - энергия одного такого фотона. Согласно [86], мгновенная вероятность возбуждения флуорофора при одновременном поглощении двух фотонов равна
p(r,t) = 'Z2I?(r-rf,zf,t)/e2ex,
где 1.2 ~ сечение двухфотонного поглощения, имеющее размерность СМ4с/ф0Т0Н, вех — энергия одного фотона накачки, a lex - мгновенное значение интенсивности накачки, связанное с мгновенной мощностью:
Р (Ґ)
L(r,zf,t)

S0{z,zf)
(2.13)
Поскольку характерное время жизни флуорофоров составляет единицы наносекунд, в большинстве задач можно считать процесс поглощения фемтосекундного импульса мгновенным по сравнению со временем высвечивания, а воздействие двух последовательных импульсов возбуждения - независимым. Таким образом, число фотонов флуоресценции, образовавшихся в окрестности точки г за время одного импульса, можно вычислить как [45]:
«(ГГ )
лгы,Xехр
2(r-r/)i
S0 (z, z,)
где Ртах — пиковая мощность, а Т)г — квантовый выход флуоресценции при двухфотонном поглощении. Количество таких фотонов за одну секунду равно: