Тканеспецифичные особенности экспрессии генов, ассоциированных со стрессом эндоплазматического ретикулума под действием гомоцистеина

• Автор: Меситов, Михаил Валентинович
• Шифр специальности: 14.03.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Г лава 1. Обзор литературы
1.1. Функции и структурные компоненты эндоплазматического 15 ретикулума
1.2. Сигнальные пути системы UPR (Unfolded Protein Response) 27 эндоплазматического ретикулума
1.2.1. Сигнальный путь IRE 1-ХВР1
1.2.2. Сигнальный путь ATF6
1.2.3. Сигнальный путь PERK-ATF4
1.2.4. Механизмы апоптоза, индуцированного стрессом ЭПР
1.3. Гипергомоцистеинемия и клеточный стресс
1.3.1. Метаболизм гомоцистеина
1.3.2. Токсичность гомоцистеина
1.3.3. Гипергомоцистеинемия и сердечно-сосудистые 66 заболевания
Глава 2. Материалы, объекты и методы исследования
2.1. Материалы и объекты исследования
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Клеточные линии человека
2.1.3. Животные
2.2. Методы исследования
2.2.1. Субкультивирование клеток Jurkat
2.2.2. Субкультивирование клеток EA.hy926
2.2.3. Оценка жизнеспособности клеток методом исключения
красителя (трипановый синий)
2.2.4. Инкубация клеток с 0,Е-гомоцистеином и дитиотрейтолом

2.2.5. Моделирование токсического действия гомоцистеина in 75 vivo
2.2.6. Получение клеточной суспензии из ткани печени
2.2.7. Проточно-цитофлуориметрический анализ
2.2.8. Определение апоптотических клеток по окрашиванию 78 ДНК пропидий йодидом
2.2.9. Анализ клеточного цикла
2.2.10. Иммуноцитохимия
2.2.11. Выделение суммарной РНК из культивируемых клеток
2.2.12. Спектрофотометрическое определение содержания 83 суммарной РНК в образцах
2.2.13. Электрофорез РНК в агарозном геле
2.2.14. Приготовление образцов суммарной РНК, свободной от 85 ДНК
2.2.15. Флуориметрическое определение содержания суммарной 86 РНК в образцах
2.2.16. Синтез первой цепи комплементарной ДНК
2.2.17. Полимеразная цепная реакция «в реальном времени» 87 (ПЦР-РВ)
2.2.18. Анализ результатов ПЦР-РВ
2.2.19. Статистическая обработка данных
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1. Морфофункциональные особенности эндоплазматического 91 ретикулума в клеточных линиях EA.hy926 и Jurkat
3.2. Изменения экспрессии генов системы UPR в клетках линий 93 человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием П,Ь-гомоцистеина и дитиотрейтола
3.2.1. Изменение уровня сплайсинговой формы гена ХВР1

3.2.2. Изменение уровня мРНК гена BiP
3.2.3. Изменение уровня мРНК гена CHOP
3.2.4. Изменения уровней мРНК генов PDIA3, PERK и GADD34
3.3. Динамика внутриклеточной концентрации белковых продуктов 104 генов стрессового ответа в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat,
под воздействием BJL-гомоцистеина и дитиотрейтола
3.3.1. Изменение внутриклеточного содержания белка BiP
3.3.2. Изменение внутриклеточного содержания белка CHOP
3.4. Иммуноцитохимическое исследование экспрессии ЭПР- 109 резидентных белков в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием В,Е-гомоцистеина и дитиотрейтола
3.5. Оценка клеточной гибели и распределения клеток по фазам 112 клеточного цикла при действии индукторов стресса
3.6. Изменения экспрессии белковых маркеров стресса ЭПР при 117 действии избытка гомоцистеина in vivo
Заключение
Выводы
Список литературы

на поздней стадии В-клеточного лимфоцитопоэза, на которой IRE1-опосредованный сплайсинг мРНК ХВР1 необходим для конечной дифференцировки В-клеток в плазматические клетки. (Zhang K. et al, 2005). В некоторых случаях В-клеточной лимфомы в гене ХВР1 была идентифицирована мутация - однонуклеотидная замена (277G>A) в экзоне 1, приводящая к соматической миссенс-мутации (R76K) (Tate G. et al, 2009).
Последние исследования по распознаванию IRE1 структур РНК типа «стебель - петля» показали, что кроме классического субстрата мРНК ХВР1, IRE1 может специфически и быстро расщеплять соответствующую вторичную антикодоновую структуру немодифицированной транспортной РНК фенилаланина. IRE1 имеет пока единственный предполагаемый гомолог -РНКазу L (RNase L). Олигомеризация IRE1 приводит к активации РНКазной функции и формированию активного сайта распознавания и расщепления соответствующих вторичных структур РНК (Korennykh A.V. et al, 2011)
Сравнительно недавно в результате анализа совокупности мРНК, экспрессируемой клетками Drosophila melanogaster в состоянии стресса ЭПР, был открыт процесс IRE 1-зависимой деградации мРНК, ассоциированных с ЭПР (Hollien J., Weissman J.S., 2006). Этот процесс, возможно, представляет собой ХВР1-независимый посттраскрипционный механизм контроля ферментом IRE1 экспрессии генов в клетках, находящихся в состоянии стресса ЭПР (Ron D., Walter P., 2007).
1.2.2. Сигнальный путь ATF6
Поиск новых транскрипционных факторов, взаимодействующих с энхансерными элементами, представленными в промоторах генов системы UPR, привел к открытию нового важного звена ответа на стресс ЭПР - фактора активации транскрипции 6, ATF6 (Haze K. et al, 1999). В данную группу энхансерных элементов входит, в частности, ERSE, который специфически