Эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур

• Автор: Походенко, Павел Алексеевич
• Шифр специальности: 06.01.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Цель и задачи исследований
Научная новизна результатов исследований
Практическая значимость и реализация результатов исследований
Основные положения, выставляемые на защиту
Предмет исследований
Апробация работы
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Видовой состав вирусов косточковых культур
в Европейской части России
1.2. Основные вирусы, поражающие косточковые культуры
1.3. Методы диагностики вирусов косточковых культур
1.3.1. Иммуноферментный анализ
1.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1.3.2.1. Особенности метода полимеразной цепной реакции
1.3.2.2. Применение ПЦР-теста для диагностики вирусов
косточковых культур
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Время и место проведения исследований
2.2. Объекты исследований и их характеристика
2.3. Методика маршрутных обследований и тестирования растительных образцов на наличие вирусов
2.3.1. Методика проведения ИФА
2.3.2. Методика выполнения ПЦР
2.3.2.1. ОТ-ПЦР
2.3.2.2. ОТ-ПЦР в реальном времени
2.3.3. Тестирование на древесных индикаторах
2.4. Элементы учета и наблюдений
2.5. Методы статистической обработки данных

2.6. Расчет экономической эффективности
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изучение распространенности и вредоносности вирусов на косточковых культурах
3.2. Сравнительная оценка эффективности выявления вируса
РРУ с использованием методов ИФА и ПНР
3.2.1. Эффективность выявления вируса РРУ в зависимости
от тестируемого органа растения
3.2.2. Эффективность тестирования в зависимости от
длительности хранения образцов листьев
3.2.3. Диагностика вируса РРУ в пробирочных и
адаптированных к нестерильным условиям растениях сливы
3.3. Совершенствование метода экстракции РНК вируса из растительных образцов
3.4. Эффективность выявления вируса шарки сливы на древесных индикаторах вишни войлочной в зависимости
от способа прививки
Глава 4. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ
МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ
ВЫВОДЫ
РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Вирусные и фитоплазменные заболевания вследствие хронического характера и высокой вредоносности считаются одним из лимитирующих факторов повышения урожайности косточковых культур. Наиболее вредоносным вирусом на этих культурах является потивирус шарки сливы (PPV), вызывающий существенное снижение урожая в результате преждевременного опадения плодов и снижения их вкусовых и товарных качеств. В середине прошлого века шарка едва не привела к вырождению культуры сливы в Югославии и Болгарии и вызвала необходимость вырубки сотен тысяч деревьев (Christoff, 1947; Jordovic, 1963). В условиях Молдовы потери урожая у восприимчивых к шарке сортов сливы составляют 70 % и более (Вердеревская, Маринеску, 1985). В бывшей Чехословакии заражение сливовых садов шаркой привело к снижению их продуктивности на 85 % (Blattny, Heger, 1965), а в Польше - на 50 % (Zawadzka, 1978). У больных деревьев от 20 до 100 % плодов преждевременно опадает, а вес оставшихся снижается в среднем на 20 % (Sutic et al., 1971; Zawadzka, Smolarz, 1978). Кроме того, в уцелевших плодах снижается содержание сахаров (до 25 %), а кислотность повышается, что существенно снижает их вкусовые качества и пригодность для переработки (Jordovic et al., 1971).
В 80-е годы прошлого века в европейских странах были выведены устойчивые и толерантные к шарке сорта сливы, персика и абрикоса (Kegler et al., 1986), и внедрена система сертификации посадочного материала, что позволило снизить распространенность и вредоносность наиболее часто встречающегося серотипа D PPV. Однако повсеместно было констатировано быстрое распространение высокопатогенного серотипа М этого вируса (Nemeth, 1994; Roy, Smith, 1994; Topchiiska, 1997).
Высокой вредоносностью для косточковых культур характеризуются также иларвирусы некротической кольцевой пятнистости косточковых (PNRSV) и карликовости сливы (PDV), вызывающие разнообразные болезни. Вирус PNRSV вызывает такие болезни, как некротическая кольцевая

фенольные соединения, ферменты и другие ингибиторы, которые могут вызывать прецепитацию или разрушение вирионов и тем самым искажать результаты анализа. С другой стороны, эти же вещества могут неспецифически реагировать с компонентами диагностикумов, особенно с ферментами-маркерами, что обуславливает высокие значения фона теста и тем самым маскирует присутствие вируса, особенно если его концентрация является относительно низкой. Нивелирования всех этих негативных явлений можно добиться правильным подбором экстрагирующих буферов и оптимизацией условий проведения анализа.
В качестве экстрагирующего буфера при проведении ИФА плодовых и ягодных культур на наличие вирусов обычно используется 0,03М калийнофосфатный буфер, pH 7,4, содержащий 0,5 % Твин-20 (PBST). Однако уже на разных этапах разработки метода ИФА было установлено, что данный буфер очень часто не обеспечивает надлежащего ингибирования неспецифических реакций. Предложенное М. Кларком с соавторами (С1агк et al., 1976) дополнительное введение в его состав 1-2 % поливинилпирролидона (ПВП) в этом плане оказалось очень удачным. Буфер PBST+ПВП был признан стандартным и широко применяется и в настоящее время. Однако дальнейшие исследования показали, что для некоторых комбинаций вирус-хозяин необходима разработка еще более эффективных экстрагирующих смесей. Так, в Англии для выявления вируса ACLSV на абрикосе целесообразным признано дополнительное введение в состав буфера диэтилдитиокарбамата натрия (ДИЕКА) (Flegg, С1агк, 1979). Однако во Франции использование ДИЕКА не давало никакого эффекта, а для достоверного выявления ACLSV на сливе и абрикосе требовалось обязательное включение никотин-основания (2,5 %), хлористого магния (0,005 М) или диаминодипропиламина (0,2 %) (Detienne et al., 1980). В Испании для выявления этого вируса на персике было достаточно использовать стандартный экстрагирующей буфер, но на абрикосе требовалось дополнительно применять следующие добавки: 0,2% ДИЕКА + 0,2% альбумин + 2,5% никотин- основание (Cambra et al., 1983).