Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Рогоза, Татьяна Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 147 с. : ил.

Оглавление:

Введение
1. Прионы дрожжей S. cerevisiae и способы их поиска (Обзор литературы)
1.1. Модели прионизации
1.2. Наследственные детерминанты [PSI] и [URE3]
1.3. Критерии прионного наследования
1.4. Структура белков Sup35 и Ure2
1.5. Прионоподобный детерминант [PIN']
1.6. Прионы [SWt], [ОСТ*], [МОТЗ+], [MCA]
1.7. Прионы дрожжей и шапероны
1.8. Возможная биологическая роль прионов дрожжей S. cerevisiae
1.9. Прионоподобный детерминант [AS7jl]
2. Материалы и методы
2.1. Штаммы
2.2. Плазмиды
2.3. Среды и условия культивирования
2.4. Генетические методы
2.5. Молекулярно-генетические методы
2.6 Методы флуоресцентной микроскопии
2.7. Измерение площади клеток
2.8. Статистические методы
3. Результаты
3.1. Трансформация штамма 25-25-2В-П3982 [ISP+] инсерционным Банком генов
3.2. Генетический анализ интегрантов, проявляющих фенотип Sup+
3.3. Генетический анализ интегрантов, потерявших [ISP +]
3.4. Генетический анализ интегрантов, сохранивших фенотип Sup'
3.5. Идентификация точки инсерции транспозона тТпЗ
3.6.Секвенирование плазмид р0.1, рб.4 и р9.1 и анализ полученных данных
3.7. Анализ отобранных интегрантов с использованием ПЦР
3.8. Изучение влияния продуктов генов JPF1 и JPF2 на [/АР ]
3.9. Изучение влияния гена АГРА на [ТАР]
3.9.1 Изучение влияния делеции гена АГРУ на [/АР+]
3.9.2 Сверхэкспрессия гена АРР7 приводит к индукции [7АР+]
3.9.3 Биохимические и цитологические доказательства связи между Бф1 и [/АР+]
3.9.3.1 Сверхэкспрессия конструкции ББРИСБР приводит к индукции [/АР+]
3.9.3.2 Биохимические доказательства агрегации белка БфЬСБР
3.9.3.3 Цитологические доказательства агрегации БфВОБР
3.9.4 Влияние прионизации Б Гр 1 р на его функции
4. Обсуждение
5. Выводы
6. Список литературы
ВВЕДЕНИЕ
Одним, из значимых событий, произошедших во второй половине XX века в биологии, стало открытие прионов. Прионами называются возбудители трансмиссивных губчатых энцефалопатий, таких как болезнь Крейцфельда-Якоба и куру человека; скрейпи у овец и «коровье бешенство» у крупного рогатого скота.
Долгое время попытки выявить возбудителя подобных заболеваний, не приводили к желаемому результату (см. Prusiner, 1982). Длительные исследования позволили установить, что возникновение прионных заболеваний связано с собственным белком организма, названным прионом от «proteinaceous infection», РгР. Этот белок способен принимать специфическую прионную конформацию и воспроизводить ее автокаталитически (см. Prusiner, 1994, cM.Prusiner, 1996).
Существование белков, проявляющих сходную по своей молекулярной природе способность к превращению в прионы, было обнаружено и у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Появление в клетке дрожжей прионной формы белка также связано с образованием специфически организованных агрегатов, называемых амилоидами, способных к автокаталитическому поддержанию и к передаче от организма к организму. Однако есть существенное различие между прионами млекопитающих и прионами дрожжей. Прионы млекопитающих — это, как уже было отмечено, инфекционные агенты, локализующиеся- на мембране клеток, а прионы дрожжей представляют собой цитоплазматические наследственные детерминанты. Таким образом, обнаружение дрожжевых прионов позволило выявить новый механизм передачи информации в ряду клеточных поколений, в основе которого лежит матричный процесс особого типа -копирование конформации одного белка другим.
К началу нашей работы было найдено три приона дрожжей: [PSt], [URE3~ и [Р//Д] (Сох, 1965; Lacroute, 1971; Derkatch et al., 1997). Актуальной

Hsp104 hexamer
Рисунок 3. Модель организации агрегатов белка Sup35 в [PSjT] клетках (по Bagriantsev et al., 2008).
Таким образом, можно сделать вывод о том, что шапероны играют важную роль в индукции, проявлении и поддержании дрожжевых прионов, хотя остается еще много вопросов о деталях взаимодействия прионов и шаперонов.
1.8. Возможная биологическая роль прионов дрожжей S.cerevisiae
Несмотря на интенсивное изучение дрожжевых прионов, вопрос об их биологической роли остается неоднозначным. В настоящее время существуют две альтернативные точки зрения на эту проблему: с одной стороны, прионы высших млекопитающих патогенны, и хотя образование и накопление прионов дрожжей не приводит к гибели клеток, ряд исследователей считают, что дрожжевые прионы также являются, скорее, патологией. С другой стороны, существует гипотеза адаптивной прионизации, которая предполагает позитивную биологическую роль прионизации в определенных условиях.
Ряд исследователей, которые придерживаются первой точки зрения, приводят в качестве аргумента тот факт, что агрегированные формы белков Sup35 и Ure2 не найдены в естественных популяциях и промышленных штаммах дрожжей S.cerevisiae, S.paradoxus и S.bayanus (Chemoff et al., 2000; Resende et al., 2003; Nakayashiki et al., 2005).