Идентификация генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA, участвующих в формировании дорзальных выростов хориона яйца Drosophila melanogaster

• Автор: Омелина, Евгения Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Структура гена Trithorax-like
1.2. Строение белка GAG А
1.3. Функции белка GAGA
1.4. Основные методы определения сайтов связывания транскрипционных факторов
1.5. Сайты связывания транскрипционного фактора GAGA
1.6. Взаимодействие GAGA с другими белками
1.7. Влияние GAGA на структуру хроматина
1.8. Ген Trithorax-like относится к группе генов ЕТР (Enhancer of trithorax and Polycomb group)
1.9. Белок GAGA является эволюционно-консервативным
1.10. Формирование дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster
1.11. Генетический контроль формирования дорзальных выростов хориона D. melanogaster
1.11.1. Сигнальный путь EGFR обусловливает начало формирования дорзальных выростов хориона
1.11.2. Сигнальный путь DECAPENTAPLEGIC контролирует развитие дорзальных выростов хориона
1.11.3. Сигнальный путь NOTCH также контролирует развитие дорзальных выростов хориона
1.11.4. Генная сеть развития дорзальных выростов хориона
Заключение и постановка задач
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы, использованные в работе
2.2. Олигонуклеотиды
2.3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
2.4. Плазмиды
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.6. Трансформация плазмидной ДНК в химически обработанные клетки E. coli
2.7. Электропорация плазмидной ДНК в «электро-компетентные» клетки E. coli
BL21/DE
2.8. Выделение плазмидной ДНК из ночной культуры
2.9. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix
2.10. Выделение плазмидной ДНК для скрининга большого количества клонов
2.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.12. Подготовка вектора для клонирования
2.13. Лигирование
2.14. Получение очищенного рекомбинантного белка с помощью HisTrap HP
колонки
2.15. Метод задержки ДНК-пробы в геле
2.16. Микроскопический анализ
2.16.1. Иммуногистохимия
2.16.2. Характеристика фенотипов яйцевых оболочек и дорзальных выростов хориона
2.17. Статистическая обработка данных, полученных при измерении длины дорзальных выростов хориона, оперкулумов и яиц мух
2.18. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях
2.19. Определение относительной экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени
2.19.1. Выделение тотальной РНК из яичников дрозофилы
2.19.2. Обратная транскрипция
2.19.3. ПЦР в реальном времени
2.19.4. Праймеры для ПЦР-РВ
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Структурные варианты GAGA-сайтов
3.2. Поиск сайтов связывания транскрипционного фактора GAGA в геноме D. melanogaster с помощью программного пакета SITECON
3.3. Экспериментальное подтверждение взаимодействия белка GAGA с предсказанными SITECON сайтами связывания
3.4. Определение потенциальных сайтов связывания GAGA в последовательностях ДНК Drosophila melanogaster
3.5. Участие гена Tri в формировании ДВХ
3.6. Гены broad, bunched, decapentaplegic, thickveins и Trithorax-like действуют скооперированно в процессе формирования ДВХ
3.6.1. Сайты связывания GAGA-фактора
3.6.2. Взаимодействие генов
3.6.3. Анализ распределения белка Вг в яйцевых камерах 7>/-мутантов
3.6.4. Анализ относительного количества транскриптов генов hr, bun, dpp, tkv в яйцевых камерах мух дикого типа и 7У7-мутантов
3.7. saxophone и gurken являются генами-мишенями GAGA-фактора
3.7.1. Сайты связывания транскрипционного фактора GAGA
3.7.2. Анализ генетического взаимодействия Tri с генами sax и grk в процессе формирования ДВХ
3.7.3. Анализ влияния 7>/-мутаций на локализацию белка Grk
3.7.4. Относительная экспрессия генов sax и grk в яйцевых камерах мух дикого типа и 7>/-мутантов
3.8. GAG А-фактор участвует в регуляции экспрессии гена Notch
3.8.1. Сайты связывания GAGA-фактора в регуляторных областях гена Notch
3.8.2. Анализ взаимодействия генов Tri и Notch в ходе формирования ДВХ
3.8.3. Анализ влияния Tri мутаций на локализацию белка Notch
3.8.4. Анализ относительного количества транскриптов гена Notch в яйцевых камерах Trl362/TrlR85-мутантов по сравнению с диким типом
3.9. Модификация генной сети, контролирующей формирование ДВХ
Заключение
Выводы
Список литературы
Приложение
Приложение

поверхности (Shi and Massague, 2003). Это позволяет рецептору II типа фосфорилировать киназный домен рецепторов I типа, которые далее передают сигнал в ядро посредством фосфорилирования белков SMAD. Существует 8 различных белков SMAD, которые подразделяются на 3 функциональных класса: рецептор-регулируемые, например MOTHERS AGAINST DPP (MAD), белки-посредники - комедиаторы, например MEDEA (MED), и ингибирующие, например DAUGHTERS AGAINST DPP (DAD). MAD напрямую фосфорилируется и активируется киназами рецепторов I типа, проходит гомотримеризацию и формирует гетеромерные комплексы с MED. Получившиеся в результате активные комплексы проникают в ядро и в сочетании с другими ядерными кофакторами опосредуют активацию или репрессию транскрипции многих генов-мишеней (Dobens and Raftery, 1998; Kretzschmar and Massague, 1998; Massague, 1998; Shi and Massague, 2003). DAD, относящийся к классу ингибирующих SMAD-белков, кодируется геном-мишенью DPP-сигнального пути, поскольку экспрессия dad запускается активным гетероолигомером MAD-MED (Рис. 7). В свою очередь DAD ингибирует активность DPP-сигнала, поскольку стабильно связывается с рецептором TKV и тем самым подавляет TKV-индуцированное фосфорилирование MAD. Кроме того, DAD может блокировать взаимодействие MAD и MED, а также перенос получившихся активных комплексов MAD/MED в ядро (Inoue et al., 1998).
Рис. 7. Схема сигнального пути DPP. Темно-серым цветом показан лиганд DPP. Жирными стрелками обозначен процесс фосфорилирования.
Взаимодействующий с DPP-сигнальным путем ген Myocyte enhancer factor 2 {Meß) кодирует одноименный транскрипционный фактор и экспрессируется в