Деструкция аминоароматических веществ анаэробными микробными сообществами

• Автор: Линькова, Юлия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2. ВВЕДЕНИЕ
3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
3.1. Метаболизм ароматических соединений
3.1.1. Аэробная деградация
3.1.2. Анаэробная деградация
3.1.3. Альтернативный (гибридный) путь деградации
3.2 Микроорганизмы, анаэробно расщепляющие аминоароматические
субстраты
3.2.1. Чистые культуры
3.2.2. Микробные сообщества
3.2.2.1. Синтрофные взаимодействия
3.2.2.2. Сложность и устойчивость микробных сообществ
3.2.2.3. Консорциумы микроорганизмов, разрушающие 22 ароматические вещества, и их трофическая структура
3.3. Влияние различных факторов на структуру сообщества
3.3.1. Природа субстрата и состав среды
3.3.2. Температура
3.3.3. Изменение состава сообщества во времени
3.4 Пространственная структура анаэробных сообществ, разлагающих
вещества-загрязнители
3.4.1. Образование анаэробных агрегатов и их влияние на процессы
деградации
3.4.2. Каналы как важная структура микробных агрегатов
3.5. Современные методы анализа состава микробных сообществ
3.6 Заключение
4. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
5.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1.1. Источники биологического материала
5.1.2. Использованные реактивы
5.1.3. Условия культивирования

5.1.4. Выделение чистых культур из анаэробных сообществ
5.1.5. Молекулярно-биологические методы
5.1.5.1. Выделение ДНК
5.1.5.2. ПЦР-амплификация
5.1.5.3. Разделение ПЦР-продуктов методом ДГГЭ
5.1.5.4. Секвенирование ДНК-фрагментов
5.1.6. Аналитические методы
5.1.6.1. Определение концентраций субстратов и продуктов их
деградации
5.1.6.2. Определение токсичности ароматических субстратов в
анаэробных условиях
5.1.6.3. Определение содержания белка
5.1.6.4. Определение аммоний-ионов
5.1.6.5. Определение содержания лактата
5.1.6.6. АР 1-тесты
5.1.7. Микроскопические методы
5.1.7.1. Световая микроскопия
5.1.7.2. Электронная сканирующая микроскопия
5.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5.2.1. Получение накопительных культур, использующих в своём
метаболизме аминоароматические вещества
5.2.1.1. Схемы получения накопительных культур 5
5.2.1.2. Накопительные культуры, выделенные из илов
очистных сооружений
Накопительная культура 04
Накопительная культура Р2
Накопительная культура ЕР
5.2.1.3. Накопительные культуры, выделенные из естественных
мест обитания
Накопительные культуры из донных отложений
реки Джамна (Индия)
Накопительные культуры, полученные из донных
отложений озера Цайдам (Бурятия)
5.2.2. Свойства выделенных активных и стабильных накопительных
культур
5.2.2.1. Культуральные признаки, морфология агрегатов и

микроскопическая картина активных накопительных культур в сравнении с неактивными
5.22.2. Определение роли небиологических факторов (физико- 71 химических параметров) в процессе деградации
ксенобиотиков. Токсичность использованных аминоароматических субстратов
Адсорбция
Гидродинамические условия (перемешивание)
Температура, освещенность, pH,
аминоароматический субстрат
Токсичность использованных
аминоароматических субстратов
5.2.3. Общая характеристика процесса биодеструкции 88 аминоароматических субстратов
5.2.4. Стимуляция процесса деградации при добавлении
дополнительных источников углерода и энергии
5.2.5. Интермедиаты процесса биодеструкции аминоароматических
кислот и возможности использования сообществами других ароматических субстратов
5.2.5.1. Идентификация интермедиатов процесса- и 92 трансформация других ароматических веществ
5.2.5.2. Токсичность интермедиатов процесса биодеградации 98 аминобензойных кислот
5.2.5.3. Влияние пирувата на процесс деструкции
интермедиатов анаэробной биоконверсии
аминобензойных кислот
5.2.5.4. Определение биохимического пути деструкции
аминоароматики
5.2.6. Пространственная организация и компонентный состав активных
сообществ
5.2.6.1. Морфотипы клеток, изменение микроскопической
картины на разных стадиях процесса, смена доминирующих видов
5.2.6.2. Агрегирование микробного сообщества
5.2.6.3. Функциональные группы микроорганизмов в
выделенных накопительных культурах
5.2.6.4. Бесспоровые микроорганизмы-члены сообщества и их
возможные функции в процессе
5.2.6.5. Гетеротрофные микроорганизмы в сообществе
5.2.6.6. Филогенетический анализ состава сообществ
5.2.7. Выделение чистых культур микроорганизмов, входящих в
микробные сообщества, разрушающие аминоароматику
5.2.7.1. Особенности выделения чистых культур с учётом их
функционирования в составе синтрофных анаэробных микробных сообществ
Как правило, метаногенная активность наблюдается преимущественно в сердцевине агрегатов, вокруг располагаются области бродилыциков или сульфатредукторов (Fang, 2000; Gonzalez-Gil et al., 2001; Satoh et al., 2007).
Структура самой гранулы существенно зависит от пути деградации ксенобиотика и его концентрации. Как правило, неслоистая (гомогенная) структура возникает при наличии постоянного тока субстрата и отсутствии какого-либо лимитирования со стороны интермедиатов (Fang et al., 1995; Rocheleau et al., 1999). Слоистая организация формируется в случае высокого содержания загрязнителя в сточных водах, а кластерная преобладает в разбавленных системах (Gonzalez-Gil et al., 2001).
3.5. Современные методы анализа состава микробных сообществ
За последние десятилетия было разработано довольно много молекулярнобиологических методов для характеристики микробного разнообразия в природных местообитаниях, основанных на экстрагировании и исследовании тотальной ДНК микробного сообщества, в результате чего появилась возможность осуществлять выявление и идентификацию известных микроорганизмов в образцах без выделения их в i чистые культуры, а также выявлять в образце новые, неидентифицированые ранее, организмы (Нетрусов и др., 2005; Zengler, 2009).
Для исследования микробного разнообразия и для определения видового состава наиболее подходящим является клонирование ПЦР-амплификатов 16S рДНК. Однако ввиду того, что этот метод довольно трудоёмок и требует больших затрат времени, он не *, подходит для изучения сукцессионных изменений популяций в микробном сообществе, которое, по сути, является одной из основных задач микробной экологии (Marshall, 1993). Для данных целей намного лучше подходят методы генетического фингерпринтинга. Они позволяют сравнивать одновременно как генетическое разнообразие микробных сообществ из различных мест обитания, так и изучать изменения во времени, происходящие в микробных сообществах. К этим методам относятся денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ, DGGE в английской транскрипции), температурный градиентный гель-электрофорез (ТГГЭ, TGGE в английской транскрипции), анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (метод, основанный на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул, SSCP), анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (ПДРФ-анализ) и некоторые другие (Muyzer, 1999). Для сравнительного анализа микробных сообществ используют метод T-RFLP, основанный на анализе