Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C

• Автор: Эльберт, Елизавета Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Анти-HCV IgG - антитела класса G к белкам вируса гепатита С Анти-HCV IgM - антитела класса М к ядерным белкам вируса гепатита С Анти-HCV - суммарные (IgG + IgM) антитела к белкам вируса гепатита
Анти-НВсоге - суммарные антитела к ядерному антигену
ВГВ - вирус гепатита В
ВГС - вирус гепатита С
ГИФА - гибридизационно-ферментная детекция результатов
амплификации ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
кДНК - комплементарная ДНК
копий/мл - копий в 1 мл
МЕ/мл - международные единицы в 1 мл
МСО - международный стандартный образец
ОСО - отраслевой стандартный образец
ОТ - реакция обратной транскрипции
РНК - рибонуклеиновая кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РСО - рабочий стандартный образец
СКРС - сыворотка крупного рогатого скота для культуры тканей
СОП - стандартный образец предприятия
ТУ - технические условия
ФСП - фармакопейная статья предприятия
HBV - вирус гепатита В
HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В
HBcAg - ядерный «соге» антиген вируса гепатита В
HBeAg - ядерный «е» антиген вируса гепатита В
НСУ - вирус гепатита С
РЫТ - одновременная детекция результатов амплификации в
процессе амплификации в режиме «реального времени»
БЕР - детекция результатов амплификации по окончании процесса
амплификации по «конечной точке»
КТ - реакция обратной транскрипции

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Эпидемиология и этиологические факторы
1. Вирус гепатита В
2. Вирус гепатита С
II. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов ВиС
1. Серологическая диагностика ВГВ
2. Серологическая диагностика ВГС
3. Молекулярно-биологические методы
4. Выявление ДНК/РНК вирусов гепатита В и С в крови, плазме, сыворотке
III. Валидация аналитических методов
IV. Стандартные образцы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В
и РНК вируса гепатита С
3.1.1. Изучение наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с электрофоретической детекцией
3.1.2 Изучение наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов ПЦР в процессе амплификации в режиме «реального времени» или по
окончании амплификации по «конечной точке»
3.1.3. Изучение наборов реагентов для выявления РНК вируса
гепатита С методом ПЦР с электрофоретической детекцией
3.1.4 . Изучение наборов реагентов для выявления РНК виру-

не позволяют объективно оценивать концентрацию нуклеиновых кислот и приводят к существенным ошибкам в трактовке полученных результатов. Действенным способом при проведении количественного определения ДНК или РНК стало применение внутреннего контрольного образца, существенно, отличающегося по своей нуклеотидной последовательности от исследуемого образца. Использование внутреннего контрольного образца в ходе реакции в той же пробирке, в которой происходит определение искомой ДНК или РНК, позволяет учесть эффект неравномерности протекания реакции. Внутренний контрольный образец, добавленный в реакцию в известных количествах, также одновременно является стандартным образцом, относительно которого вычисляется концентрация ДРЕК или РНК в исследуемых образцах (по принципу конкурентной ПЦР). Концентрация ДНК или РНК в исследуемом материале рассчитывается на основании известной концентрации внутреннего контрольного образца и соотношения накопления продуктов амплификации внутреннего контрольного образца и определяемой матрицы. Внутренний контрольный образец также позволяет выявлять возможное ингибирование реакции.
Методы детекции продуктов амплификации
Для детекции продуктов амплификации (ПЦР) применяют несколько способов. Наиболее распространенным из них является электрофоретическое разделение ампликонов в агарозном или полиакриалмидном гелях с детекцией ДНК в ультрафиолетовом свете при помощи интеркалирующих красителей, например, этидия бромида [134].
Гибридизационно-ферментные методы детекции основаны на использовании меченых компонентов реакции и иммуноферментном выявлении продуктов амплификации. Для этого применяют праймеры, меченные биотином, соответственно меченным оказывается и продукт реакции амплификации - ампликон. Далее так же, как при иммуноферментном анализе, добавляется хромоген, например, ТМБ, и субстрат для проведения