Генотипирование вируса африканской чумы лошадей различных серотипов

• Автор: Титов, Илья Андреевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 106 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность темы
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цель и задачи исследования
1.4 Научная новизна результатов исследований
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
1.6 Степень достоверности и апробация результатов работы
1.7 Публикации научных исследований
1.8 Основные положения, выносимые на защиту
1.9 Объём и структура работы
1.10 Личный вклад соискателя
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Характеристика вируса АЧЛ
2.1.1 Морфология вириона АЧЛ
2.1.2 Компоненты вириона АЧЛ
2.1.3 Механизм вирусной репликации
2.1.4 Структурная организация генома и полипептидный состав вируса
2.1.5 Устойчивость к физико-химическим воздействиям
2.1.6 Антигенные свойства вируса АЧЛ
2.2 Восприимчивые к АЧЛ животные
2.3 Природные очаги и роль переносчиков при вспышках АЧЛ
2.4 Клиническая картина АЧЛ
2.5 Эпизоотическая ситуация по АЧЛ в мире
2.6 Диагностика АЧЛ
2.6.1 Выделение вируса из проб патологического материала
2.6.2 Индикация вируса при помощи реакции связывания комплимента
2.6.3 Индикация вируса АЧЛ при помощи реакции диффузной
преципитации
2.6.4 Типизация вируса. Реакция нейтрализации
2.6.5 Реакция задержки гемагглютинации
2.7 Применение ПЦР в индикации вируса АЧЛ
2.8 Филогенетический анализ вируса АЧЛ молекулярногенетическими методами

2.9 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы
3.1.1 Вирусы
3.1.2 Культуры клеток
3.1.3 Образцы патологического материала
3.1.4 Животные
3.1.5 Плазмиды и бактериальные штаммы
3.1.6 Реактивы
3.1.7 Лабораторное оборудование
3.2 МЕТОДЫ
3.2.1 Подбор праймеров и зондов
3.2.2 Выделение нуклеиновых кислот
3.2.3 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации
методом электрофореза
3.2.4 Анализ ПЦР-продуктов
3.2.5 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.2.6 Нуклеотидное секвенирование
3.2.7 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидных
последовательностей фрагментов генома вируса АЧЛ, построение филогенетических дендрограмм
3.2.8 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР
3.2.9 Заражение культур клеток, мышей, чувствительных животных
3.3 Статистическая обработка результатов диссертации
4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1 Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени
4.1.1 Дизайн специфических праймеров и зонда, использованных в
тест-системе
4.1.2 Оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реального
времени
4.1.3 Определение чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР в
режиме реального времени
4.2 Экспериментальное воспроизведение АЧЛ
4.2.1 Клинические признаки болезни
4.2.2 Молекулярно-генетические исследования

4.3 Филогенетический анализ различных штаммов вируса АЧЛ и
определение их серотиповой принадлежности
4.3.1 Филогенетический анализ 7 и 10 сегментов генома вируса АЧЛ
4.3.2 Филогенетический анализ 2 сегмента генома вируса АЧЛ
5 ОБСУЖДЕНИЕ
6 ВЫВОДЫ
7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
9 ПРИЛОЖЕНИЯ

кодируется вторым сегментом генома. Podgeiter A.C., Dijk A.et al. (2003) с помощью неспецифической амплификации получили полноразмерный ПЦР-продукт десяти сегментов генома АЧЛ всех серотипов, который был разделён в 1% агарозном геле. Затем было произведено клонирование, нуклеотидное секвенирование и встраивание гена, кодирующего VP2 в бакуловирусный вектор с целью трансляции белка. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена VP2 показало, что он является наиболее вариабельным сегментом генома АЧЛ и процент его гомологии между различными серотипами может составлять от 47,6 до 71,4%.
Генотипировать различные серотипы вируса АЧЛ при помощи ОТ-ПЦР удалось Sailleau C., Zientara S.et al. (2000). Ими был подобран ряд группо- и серотипо-специфических праймеров на различные участки второго сегмента генома АЧЛ, что позволило получить специфический ПЦР- продукт для каждого серотипа вируса АЧЛ. Детекция полученных ПЦР-продуктов производилась в 2% агарозном геле. Однако последующее секвенирование наработанных в ходе ПЦР продуктов не проводилось.
В настоящее время учёными из Испании производится филогенетический анализ изолятов АЧЛ, завезённых в Испанию из Намибии в 1987 году. При помощи секвенирования участков 2 (353п.о.) и 7 (420п.о.) сегментов генома вируса была подтверждена его принадлежность к 4 серотипу и прослежено накопление изменений в геноме в ходе географического распространения вируса на территории Испании.
Работы по генотипированию вируса АЧЛ проводились также и на основании полноразмерных последовательностей 10 сегмента вирусной РНК, с последующим построением филогенетических дендрограмм и разделением использованных в работе изолятов на группы. Таким образом была подтверждена принадлежность к 9 серотипу изолята, выделенного в Сенегале в 1998 году (Sailleau C., Seignot J., Zientara S. 2000). На основании последовательности 10 сегмента РНК предпринимались и более масштабные