Механизмы защитного действия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток при экспериментальном остром пиелонефрите

• Автор: Пулькова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 182 с. : ил.

Введение
Обзор литературы
Пиелонефрит
Медицинские аспекты пиелонефрита
Моделирование пиелонефрита
Механизмы развития пиелонефрита
Цитокины, хемокины и молекулы клеточной адгезии в развитии
пиелонефрита
Роль толл-подобных рецепторов в развитии пиелонефрита
Иммунологические реакции при пиелонефрите
Активные формы кислорода и азота при воспалении
Ишемическое и фармакологическое прекондиционирование
Матриксные металлопротеиназы
Применение стволовых клеток для лечения почечных патологий
Биология стволовых клеток
Типы стволовых клеток, используемых для нефропротекции
Влияние ММСК на воспалительный процесс
Общая характеристика ММСК
Миграционная способность ММСК
Иммуномодулирующие свойства ММСК
Влияние ММСК на активность матриксных металлопротеиназ
Материалы и методы исследования
Материалы
Методы
Эксперименты на культурах клеток
Получение и ведение культуры мезенхимальных мультипотентных
стромальных клеток
Выделение лейкоцитов из периферической крови
Инкубация культуры ММСК с лейкоцитами и ЛПС или LiCI
Микроскопическое исследование клеток
Оценка продукции активных форм кислорода
Проточная цитофлуориметрия
Оценка продукции оксида азота
Оценка митохондриального трансмембранного потенциала
Иммуноцитохимия (адгезивные и суспензионные клетки)
Определение активности матриксных металлопротеиназ
Мечение клеток кальцеином зеленым и микрочастицами оксида железа

Оценка миграции клеток in vitro
Эксперименты на животных
Моделирование острого пиелонефрита у крыс
Приготовление инокулята фекальных бактерий крыс
Определение количества малонового диальдегида в тканях почек
Определение продукции фактора некроза опухоли и нитрата/нитрита
Определение активности миелопероксидазы в тканях почек
Оценка интенсивности флуоресценции кальцеина в тканях почек
Гистологическое исследование почек
Гематологический и биохимический анализ крови крыс
Определение числа лейкоцитов в суточной моче крыс
Определение концентрации белка
Иммуноблоттинг
Статистика
Результаты
Влияние ММСК на окислительный стресс и развитие воспаления при
экспериментальном остром пиелонефрите
Влияние ММСК на морфологические изменения в почке после индукции
острого пиелонефрита у крыс
Миграция экзогенных ММСК в ткани поврежденной почки
Влияние активированных лейкоцитов на ММСК в культуре
Сокультивирование с лейкоцитами индуцирует в ММСК запуск сигнальных
путей, аналогичных фармакологическому прекондиционированию ЫС1
Влияние ММСК, прекондиционированных ионами лития или воспалением,
на течение острого пиелонефрита у крыс
Обсуждение
Выводы
Список литературы
Список сокращений
АФА - активные формы азота
АФК - активные формы кислорода
ГСК - гемопоэтические стволовые клетки
ДМСО - диметилсульфоксид
ИПК - ишемическое прекондиционирование
ЛПС - липополисахарид
ЛЦ - лейкоциты
МДА - малоновый диальдегид
ММП - матриксная металлопротеиназа
ММСК - мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки
мпо - миелопероксидаза
мчож - микрочастицы оксида железа
ПК -прекондиционирование
ппс - полная питательная среда
ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат
ФМСФ - фенилметилсульфонил флуорид
ФЭ -фикоэритрин
ЭДТА - этилендиамин тетраацетат
ЭСК - эмбриональные стволовые клетки
сАМР - циклический аденозинмонофосфат
ВБА - бычий сывороточный альбумин
ЬР6Р - основной фактор роста фибробластов
СОХ - циклооксигеназа

Н202, а ДМСО нейтрализует ОН-радикал, эти данные указывают на то, что оба эти вида АФК генерируются при развитии инфекции в почке и задействованы в патогенезе пиелонефрита.
Также можно упомянуть, что группой Уедеп было показано увеличение продукции АФК в почках, ведущее к снижению почечных функций и разрушению паренхимы в результате воспалительного процесса (Sener et al., 2006; Biyikli et al., 2006). При этом было подтверждено, что основной вклад в окислительный стресс вносят нейтрофилы, участвующие в воспалительном процессе.
Деструктивная функция АФК тесно взаимосвязана с функцией N0 и его метаболитов (активных форм азота). Оксид азота является эффективным регулятором внутрипочечной гемодинамики, процессов клубочковой фильтрации, а также процессов реабсорбции метаболитов из первичной мочи. Его образование происходит как в мезангиальных и эндотелиальных клетках почечных клубочков, эндотелии и гладкомышечных клетках стенки внутриорганных кровеносных сосудов (Тейлор и др., 1998; Ishimura et al., 2002), так и в канальцевом эпителии (Ishimura et al., 2002). При развитии воспалительных процессов, каковым является пиелонефрит, происходит активация синтеза N0, в первую очередь за счет лейкоцитов, мигрирующих к месту воспаления.
Изучение вопроса происхождения эндогенного N0 показало, что для его продукции активными макрофагами необходим L-аргинин. В дальнейшем было выяснено, что выработка обеспечивается семейством NO-синтаз (NOS), которые в процессе работы образуют из L-аргинина N0 и L-цитруллин, одновременно окисляя NADPH и восстанавливая кислород до воды (Горрен и Майер, 1998). Оказалось, что NOS присутствуют в клетках практически всех типов тканей, и по типу экспрессии их разделяют на конститутивно присутствующие в клетках cNOS и индуцибельные iNOS. Группа cNOS обычно делится на нейрональную nNOS (NOS1) и эндотелиальную eNOS (NOS3) по месту их основной локализации, хотя они могут находиться и в других клетках. iNOS ассоциирована в основном с макрофагами и участвует в работе иммунной системы (Albina and Reichner, 1998), накапливаясь в этих клетках после активации их цитокинами (IFN-y, IL-lp , TNFa) и другими агентами (липополисахариды). В печени при стимуляции также экспрессируется эта изоформа, что связано с барьерной функцией этого органа (Тейлор и др., 1998). Комплексное изучение NOS показало, что они являются одними из наиболее сложно устроенных и регулируемых ферментов, имеющих необычно высокое количество