Высшие уровни организации генетического аппарата эукариот и регуляция функциональной активности генома

• Автор: Киреев, Игорь Игоревич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 400 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Структурная организация хроматина
2Л.Е Начальные уровни компактизации хроматина:
нуклеосомы и элементарная фибрилла хроматина
2.1.2. Высшие уровни организации хроматина
2Л.З. Роль ядерного матрикса и хромосомного
скэффолда в формировании пелевых доменов хроматина
2Л .4. ДНК-белковые взаимодействия, определяющие
петлевую организацию генома
2Л.5. Высшие уровни организации хроматина в
интактных клетках
2Л.6. Линейная неоднородность митотических
хромосом
2.2. Структура и функция конденсинов
2.2.1. Семейство БМС-белков
2.2.2. Функции конденсинов в митозе
2.2.3. Биохимические активности конденсинов
2.2.4'. Взаимодействие конденсинов с ДНК.
2.2.5. Конденсины и компактизация хромосом.
2.2.6. Взаимодействие топоизомеразы II и конденсина в 58 митотических хромосомах
2.2.7. Фосфорилирование и регуляция конденсинов
2.2.8. Роль регуляторных субъединиц конденсина в 63 связывании с хромосомами
2.2.8. Другие факторы, участвующие в рекрутировании 65 конденсинов
2.2.9. Взаимодействие субъединиц в составе
конденсинового комплекса
2.2.10. Роль конденсинов в регуляции транскрипции
2.3. Структурная организация реплицирующегося хроматина
2.3.1. Домены хроматина и репликация
2.3.1. Репликативная организация нативного хроматина: репликативные сайты
2.3.2. Ультраструктура репликационного сайта
2.4. Структурная организация хроматина и регуляция транскрипции
2.4.1. Регуляция транскрипции на уровне нуклеосом
2.4.2. Петлевые домены и транскрипция
2.4.3. Пространственная организация транскрипции: транскрипционные фабрики
2.4.4. Роль хроматиновых фибрилл высшего порядка в регуляции транскрипции
2.4.5. Взаимосвязь транскрипционной активности генов с пространственной организацией интерфазного ядра: хромосомные территории
2.4.6. Регуляция транскрипции в масштабах целой хромосомы: инактивация Х-хромосомы
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
3. МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Растворы
3.2. Векторы и их модификация
3.3. Культура клеток
3.4. Синхронизация клеток
3.5. Получение трансгенных клеточных линий
3.6. Ингибирование транскрипции
3.7. Световая микроскопия и иммунофлуоресценция
3.8. Визуализация реплицированного хроматина
3.9. Получение хромосомных препаратов и дифференциальная окраска хромосом

ЗЛО. Прижизненные наблюдения за клетками
3.11. Электронная микроскопия
3.12. Иммуноэлектронная микроскопия
3.13. Цифровая обработка изображения
3.14. In vivo иммуномечение ядерных белков
3.15. Гибридизация in situ
3.16. Определение копийности интегрированных трансгенных конструкций
3.17. Выделение РНК и РТ-ПЦР
3.18. Получение препаратов мейотических хромосом Xenopus laevis и иммуноокрашивание
3.19. Электрофорез и иммуноблоттинг
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Структурные мотивы высшего порядка в организации факультативного гетерохроматина
4.1.1. Идентификация неактивной X-хромосомы на светооптическом и электронномикроскопическом уровне
4.1.2. Ультраструктурная организация неактивной X- 148 хромосомы.
4.1.3. ЗО-структура тельца Барра.
4.1.4. Позиционирование неактивной Х-хромосомы в 157 ядре.
4.2. Динамика структурной организации хроматина в
процессе репликации
4.2.1. Визуализация репликативных сайтов в контексте 167 интактного хроматина.
4.2.2. Пост-репликативная реорганизации хроматина
4.2.3. Ультраструктура хроматина в сайтах репликации
4.2.4. Топология реплисом в реплицирующемся 178 хроматине

позволяющий весьма эффективно визуализовать хромонемы как в интерфазных, так и митотических хромосомах, заключается в пермеабилизации клеток и удалении растворимых клеточных компонентов в буферных системах, стабилизирующих компактную структуру хроматина (Ченцов, Поляков, 1974, Зацепина и др., 1983, Blumenthal et al, 1978; Горнунг и др., 1986; Фролова и др., 1988; Belmont et al, 1988). Необходимость пермеабилизации связана с тем, что традиционные методы контрастирования солями тяжелых металлов, используемые в электронной микроскопии, не обладают специфичностью по отношению к ДНК и к нуклеиновым кислотам в целом, и идентифицировать индивидуальные структурные элементы хромосом на фоне нуклеоплазмы достаточно сложно. Использование ДНК-специфичных окрасок в живых клетках в сочетании с флуоресцентной микроскопией высокого разрешения позволило оптимизировать буферные системы, сохраняющие хромосомную и ядерную морфологию близкую к таковой в интактных клетках, и визуализовать хроматиновые структуры высшего порядка более специфически на электронномикроскопическом уровне после пермеабилизации клеток (Belmont et al., 1989). Выявляемые в результате таких обработок хромонемы варьировали в диаметре от 60 нм до 200 нм. В отдельных районах ядра протяженные линейные сегменты данных структур удавалось проследить на значительном расстоянии как на светооптическом, так и на электронномикроскопическом уровне. Использование электронной томографии далее позволило продемонстрировать, что эти домены образуются в результате упорядоченной укладки протяженных участков ДНК длиной в сотни кб (Belmont Bruce 1994).
Выявление хроматиновых доменов высшего порядка с высокой контрастностью стало возможным в результате удаления растворимы