Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a

• Автор: Стратонова, Наталия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 185 с. : ил.

Содержание
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Семейство белков человеческого интерферона альфа
1.2. Влияние наличия N-концевого метионина в молекуле интерферона
альфа-2 на свойства белка
1.3. Существующие в настоящее время способы получения интерферона 19 апьфа-
1.4. Современные требования к параметрам качества субстанции интерфе- 23 рона альфа-
1.5. Способы получения интерферона без N-концевого метионина в E. coli.
1.6. Технология получения рекомбинатных белков в E. coli
1.7. Обеспечение безопасности получаемого препарата для пациента
2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Разработка технологии производства безметионинового интерферо- 48 на альфа-2Ь
2.2.1.1. Создание штамма-продуцента гибридного белка интерферона аль- 48 фа-2Ь
2.2.1.2. Исследование влияния замены редко встречающихся в E. coli ами- 53 нокислотных кодонов на уровень экспрессии гена интерферона альфа-2Ь человека в системе транскрипции бактериофага Т
2.2.1.3. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гиб- 59 ридного белка интерферона альфа-2Ь
2.2.1.3.1. Подбор оптимального состава культуральной среды
2.2.1.3.2.Азотсодержащий компонент
2.2.1.3.3. Минеральные соли

2.2.1.3.4. Факторы роста
2.2.1.3.5. Состав питательной среды для культивирования штамма ЕСЯ-
Н81-Т
2.2.1.3.6. Подбор оптимальных условий культивирования
2.2.1.3.7.Подбор схемы получения инокулята
2.2.1.3.8. Углерод содержащие субстраты и индуктор
2.2.1.3.9. Проведение установочных серий процесса культивирования в
объеме 30 л
2.2.1.4. Разработка процесса выделения и очистки тел включений гибрид-
ного белка интерферона альфа-2Ь
2.2.1.4.1. Подбор оптимальных условий процесса выделения и очистки те-
лец включений
2.2.1.5. Растворение, ренатурация и гидролиз гибридного белка
2.2.1.6.Очистка субстанции человеческого рекомбинантного безметиони-
нового интерферона альфа-2Ь
2.2.1.7. Исследование полученного человеческого рекомбинантного альфа-
2Ь безметионинового интерферона методом автоматического Ы-концевого секвенирования
2.2.1.8. Определение подлинности человеческого рекомбинантного безме-
тионинового интерферона альфа-2Ь методом пептидного картирования в сравнении с Европейским стандартным образцом
2.2.1.9. Технологическая схема
2.2.1.10. Валидация технологического процесса производства человече- 140 ского рекомбинантного безметионинового интерферона альфа-2Ь
2.2.1.12. Экономическая эффективность процесса
2.2.1.13. Перенос технологии на производственную площадку ООО «Фар-
мапарк»
2.2.2. Разработка технологии производства безметионинового интерферо-
на альфа-2а
2.2.2.1. Создание штамма-продуцента гибридного белка интерферона аль- 153 фа-2а
2.2.2.2. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гиб-
ридного белка интерферона альфа-2а
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ 164 РЕЗУЛЬТАТОВ
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1 - Патент № 2473
Приложение 2,3- Справки депонирования штаммов-продуцентов (ВКПМ)
Приложение 4 - Титульный лист ФСП № 000434-151112 на субстанию безметионинового интерферона альфа-2Ь
Приложение 5 - Титульный лист Пускового регламента ПУР 56882590-06-07 на производство субстацции безметионинового интерферона альфа-2Ь

В литературе приведено много примеров, показывающих возможность эффективной ренатурации белков из телец включения для коммерческого получения. Из нашего предыдущего опыта работы с интерфероном альфа-2Ь мы знали, что добиться ренатурации интерферона из телец включений возможно, причем с получением ренатурата с высокой концентрацией и чистотой белка.
По литературным данным (79, 72), частица SUMO, с которой слита аминокислотная последовательность интерферона альфа-2 в гибридном белке, повышает растворимость белка и выход в процессе ренатурации. Частица SUMO имеет стабильную структуру, которая легко подвергается рефолдин-гу, благодаря чему и повышается способность к рефолдингу слитого с ней белка.
Исходя из нашего опыта и литературных данных, было решено получать гибридный белок в виде телец включений, выделять, очищать, солюбилизировать их и подвергать гибридный белок рефолдингу.
1.7. Обеспечение безопасности получаемого препарата для
пациента
При разработке технологии необходимо учитывать требования безопасности, которые предъявляются к сырью и материалам, используемым в процессе производства и разработке. Согласно «Requirements for starting material of animal origin» (CMD(v)/POS/001 от 15 October 2009) в качестве любых реагентов и реактивов, используемых в производстве и разработке, не должны использоваться продукты животного происхождения. В соответствии с этим требованием в разработке и производстве использовались только реагенты с сертификатом, удостоверяющим отсутствие компонентов животного происхождения.
Согласно руководству «Impurities: Guideline for Residual Solvents» (ICH
Topic Q3C (R4)) использование растворителей 1 класса (бензола, являюще-