Молекулярные механизмы реализации геропротекторной активности пептида дельта-сна

• Автор: Кутилин, Денис Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 196 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ с
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Современные представления о молекулярных механизмах старения и геропротекции.
1.2.Строение и биологическая активность дельта-сон индуцирующего пептида (ДСИП)...26 ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.Постановка эксперимента
2.2.Получение биологического материала
2.2.1.Приготовление гемолизата эритроцитов
2.2.2.Приготовление гомогенатов тканей
2.2.3.Выделение и очистка суммарных белков тканей
2.2.4.Выделение и очистка тотальной РНК
2.2.4.Выделение и фиксация роговицы глаза
2.3.Методы исследования
2.3.1.Препаративные методы исследования
2.3.1.1.Выделение фракции, обогащенной лизосомами
2.3.1.2.Выделение митохондриальной фракции
2.3.2.Биохимические методы исследования
2.3.2.1.Определение активности глутатионпероксидазы
2.3.2.2.Определение активности глутатион-Б-трансферазы
2.3.2.3.Определение активности глутатионредуктазы
2.3.2.4.Определение содержания восстановленного глутатиона
2.3.2.5.Определение содержания белка
2.3.2.6.0пределение концентрации гемоглобина
2.3.2.7.Определение содержания вН-групп в суммарных белках тканей
2.3.2.8.Определение содержания карбонильных групп в суммарных белках тканей
2.3.2.9.Определение содержания битирозина в суммарных белках тканей
2.3.2.10.Определение активности НАДН-дегидрогеназы в митохондриальной фракции.45 2.3.2.11.Определение активности сукцинатдегидрогеназы в митохондриальной
фракции
2.3.2.12.Определение активности кислых пептидгидролаз (pH 4,5) в субклеточных
фракциях
2.3.2.13.Электрофорез РНК в денатурирующем формамидном геле агарозы
2.3.2.14.Определение профиля экспрессии генов супероксиддисмутазы 1 (СОД 1) и глутатионпероксидазы 1 (ГПО 1)

2.3.3.Цито-генетические методы исследования
2.3.3.1.Определение числа хромосомных аберраций в эпителии роговицы глаза
2.3.3.2.Определение митотического индекса в эпителии роговицы глаза
2.4.Статистическая обработка результатов исследования
ГЛАВА 3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ЗЛ.Влияние ДСИП на состояние глутатионзависимого звена антиоксидантной системы в разных тканях и эритроцитах крыс при физиологическом старении
организма
ЗЛ.Влияние ДСИП на профиль экспрессии генов СОД 1 и ГПО 1 в мозге и крови крыс при старении организма
3.3.Влияние ДСИП на активность ферментов электронтранспортной цепи митохондрий разных тканей крыс при старении организма
3.3.1.Влияние ДСИП на активность НАДН - дегидрогеназы в митохондриальной фракции мозга, сердечной мышцы и печени крыс разного возраста
3.3.2.Влияние ДСИП на активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриальной фракции мозга, сердечной мышцы и печени крыс разного возраста
3.4. Влияние ДСИП на окислительную модификацию суммарных белков разных тканей крыс при физиологическом старении организма
3.4.1.Влияние ДСИП на содержание БН-групп в суммарных белках разных тканей крыс при физиологическом старении организма
3.4.2.Влияние ДСИП на содержание карбонильных групп в суммарных белках разных тканей крыс при физиологическом старении организма
3.4.3.Влияние ДСИП на содержание битирозина в суммарных белках разных тканей крыс при физиологическом старении организма
3.5.Влияние ДСИП на состояние мембран лизосом и интенсивность лизосомального протеолиза в разных тканях крыс при старении организма
3.6.Влияние ДСИП на частоту хромосомных аберраций и митотическую активность в эпителии роговицы глаза крыс при старении организма
3.6.1.Влияние ДСИП на частоту хромосомных аберраций в эпителии роговицы глаза крыс при физиологическом старении организма
3.6.2.Влияние ДСИП на митотическую активность в эпителии роговицы глаза крыс при физиологическом старении организма
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список использованных сокращений
АОС - антиоксидантная система АТФ - аденозингрифосфат АФК - активные формы кислорода ГПО - глутатионпероксидаза ГР - глутатионредуктаза TST - глутатион-Б-трансфераза КПГ - кислые пептидгидролазы МИ - митотический индекс МАО - моноаминоксидаза МДА - малоновый диальдегид
НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СОД - супероксиддисмутаза
СДГ - сукцинатдегидрогеназа
ХДНБ -1,2-динитро-хлор-бензол
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
ЭТЦ - электронтранспортная цепь
2,4-ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидрозин
СО-группы - карбонильные группы
SH-группы - сульфгидрильные группы
АМРК - AMP activated protein kinase (АМФ-активируемая протеинкиназа)
ERK - extracellular signal-regulated kinase
FOXO - транскрипционные факторы Forkhead box «О»
Gpx 1 - ген глутатионпероксидазы
GSH - восстановленная форма глутатиона
GSSG- окисленная форма глутатиона
GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
НЬ - гемоглобин
JNK- c-Jun N-концевая киназа
МАРК - mitogen-activated protein kinase
Sod 1 - ген супероксиддисмутазы

Таблица 2.1.
Дизайн эксперимента
Условия эксперимента Кол-во животных в группе Масса тела животных (г, М±т)
2 мес. 10 161,58+10,
4 мес. 10 300,13+6,13*
4 мес.+ДСИП 10 285,50+0,84**
6 мес. 10 366,10+9,75*,***
6 мес.+ДСИП 10 363,65+5,
8 мес. 10 412,06+15,49*,***
8 мес.+ДСИП 10 416,66+9,
12 мес. 7 443,63+47,14*
12 мес.+ДСИП 8 443,59+35,
16 мес. 8 422,61+5,25*
16 мес.+ДСИП 9 417,11+11,
18 мес. 8 437,33+19,67*
18 мес.+ДСИП 8 451,00+22,
20 мес. 7 432,00+16,55*
20 мес.+ДСИП 10 435,00+22,
22 мес. 6 469,50+11,50*
22 мес.+ДСИП 6 464,00+17,
24 мес. 5 511,00+19,26*
24 мес.+ДСИП 6 546,70+16,
Примечание: * - статистически достоверные отличия по сравнению с 2 мес. животными (pi<0,05-0,001); ** - то же по сравнению с интактными животными того же возраста (рг<0,05-0,001); *** - то же по сравнению с животными предшествующей возрастной группы (рз<0,05-0,001).
В гемолизате эритроцитов и гомогенатах перечисленных выше тканей крыс разного возраста, определяли активность глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы, содержание восстановленного глутатиона, а также концентрацию сульфгидрильных и карбонильных групп, уровень битирозиновых сшивок в суммарных белках исследуемых тканей. В субклеточных фракциях мозга, сердечной мышцы и печени определяли активность НАДН-дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и пептидгидролаз (pH 4,5). Для определения профиля экспрессии генов СОД 1 и ГПО 1, часть ткани мозга (100-150 мг) помещали в пробирки эппендорф (микроцентрифужные пробирки фирмы «Axygen» (США) с маркеровкой RNase/DNase free), содержащие раствор РНК-лэйтера (насыщенный раствор сульфата аммония), и замораживали в жидком азоте, а также отбирали кровь объёмом 60 мкл и добавляли в пробирки эппендорф, содержащие 300 мкл раствора, состоящего из 4 М гуанидин-изотиоцианата, 25 мМ цитрата Na, 0,5% саркозила и 0,1 М 2-меркаптоэтанола. Образцы хранили до момента исследования в сосуде Дюара с жидким азотом. Для цитогенетического исследования после декапитации крыс извлекали глазные