Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность клеток эндотелия

• Автор: Алексеева, Анна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 183 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Клеточные сигнальные пути в эндотелии
2.1. Роль эндотелия в физиологических функциях организма
2.1.1. Барьерная роль эндотелия сосудов
2.1.2 Роль молекул ОТ-кВ и Т1Л1 в осуществлении эндотелием барьерной функции
2.1.3 Роль актинового цитоскелета в осуществлении эндотелием барьерной функции
2.1.4. Влияние окислительного стресса на барьерную функцию эндотелия
2.2. Адгезивные свойства эндотелия
2.2.1. Роль молекулы адгезии РЕСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия
2.2.2. Роль молекулы адгезии 1САМ-1 в физиологии клеток эндотелия
2.2.3. Роль молекулы адгезии УСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия
2.2.4. Роль селектинов (в частности, Е-селектина)
в физиологии клеток эндотелия
2.3. Регуляторная функция эндотелия
2.3.1. Синтез и метаболизм N
2.3.2. Роль эндотелиальной ЕЮ-синтазы в физиологии эндотелия
2.3.3. Роль индуцибельной ЫО-синтазы в физиологии эндотелия
2.3.4. Особенности выработки N0 и экспрессии ЦчЮБ и еБЮБ
в клетках культуры эндотелия НИУЕС
2.3.5. Образование в эндотелии активных форм кислорода и окислительный стресс
2.3.6. Апоптотические процессы в клетках эндотелия.
Ключевые белки и регуляторы
2.3.7. Основные клеточные сигнальные пути, активирующиеся при действии окислительного стресса
2.4. Причины и роль дисфункции эндотелия в сердечно-сосудистых, аутоиммунных и других заболеваниях
2.5. Действие на клетки фрагментов вкДНК разного состава
2.5.1. Содержание циркулирующей ДНК в крови людей
в норме и при патологии
2.5.2 Структурные особенности вкДНК
2.5.3. Микроокружение циркулирующей ДНК
2.5.4. ДНК-узнающие рецепторы и их лиганды. Участие ТЬЯ-путей в работе клеток эндотелия в норме и при патологии
2.6. Заключение по данным литературы
3. Материалы и методы
3.1. Цитологические методы. Объект исследования
3.1.1. Выделение и культивирование клеток эндотелия
3.1.2 Добавление к эндотелию фрагментов ДНК
3.1.3. Облучение, обработка и инкубирование эндотелия
3.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода
3.1.5. Культивирование эндотелия для выявления эффекта свидетеля
3.1.6. Получение клеточных лизатов
3.2. Цитохимические методы
3.2.1 Иммуноцитохимическое определение актина
3.2.2 Иммуноцитохимическое определение белков ТЬК9, А1М2,
ПЧОБ, еШБ, реШБ, N0X4, Ю-67, РСИА, р65(14Р-кВ)
3.2.3. Анализ изображений
3.2.4. Определение количества АФК методом проточной цитометрии
3.2.5. Определение содержания окиси азота в клетках методом проточной цитометрии
3.3. Получение и последующее определение свойств внеклеточной ДНК
3.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК
из среды инкубации эндотелия/ сыворотки крови
3.3.2 Получение модельных фрагментов ДНК
3.4. Биохимические методы
3.4.1. Выделение РНК из эндотелия,
определение ее концентрации и хранение
3.4.2. Выделение геномной ДНК из эндотелия,
определение ее концентрации и хранение
3.4.3. Окисление фрагментов ДНК
3.4.4 Определение относительного содержания
8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) во вкДНК
3.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде
методом Грисса
3.4.6 Определение количества метаболитов окиси азота в среде с помощью
реагента CuFL
3.4.7. Методика ДНК комет (single cell gel electrophoresis) для определения содержания одно- и двунитевых разрывов в клетках HUVEC
3.4.8. Детекция двуцепочечных разрывов ядерной ДНК методом иммунофлуоресценции
3.5. Молекулярные методы
3.5.1 Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени
3.6. Статистическая обработка
4. Результаты и обсуждение
4.1. Общая схема эксперимента
4.2. Характеристика образцов ДНК
4.2.1. Лиганды и ингибиторы TLR
4.2.2. Окисленные формы ДНК
4.2.3. Характеристика циркулирующей ДНК плазмы человека в норме, при патологии и внешнем воздействии (ионизирующее излучение)
4.3. Локализация образцов экзогенной ДНК с различными свойствами
в клетках HUVEC
4.4. Влияние GC-ДНК и ДНК0Х на экспрессию TLR
4.4.1. Изменения количества мРНК TLR

изоформы iNOS, различающиеся по способности димеризоваться (Tiscomia et al., 2004).
2.3.4. Особенности выработки NO и экспрессии iNOS и eNOS в клетках культуры
эндотелия HUVEC
Известно, что оксид азота играет важную роль при развитии и функционировании сосудов. Экспрессия ферментов, продуцирующих N0, меняется в различные моменты жизнедеятельности клетки. Динамика экспрессии индуцибельной формы NO-синтазы связана с клеточным ответом на условия существования. Показано, что при воздействии на культуру HUVEC различных факторов, таких как цитокины и глюкокортикоиды, экспрессия iNOS со временем увеличивается, в то время как уровень экспрессии конститутивной eNOS уменьшается или остается на постоянном, невысоком уровне (de Assis et al., 2002).
Кроме того, показано, что на экспрессию генов данных ферментов оказывает влияние количество пассажей. В первичной культуре и во 2-4 пассажах экспрессия генов клеточных ферментов осуществляется с различной интенсивностью, что объясняется уровнем клеточной дифференцировки, меняющимся от пассажа к пассажу (Shizukuda et al., 1999).
2.3.5. Образование в эндотелии активных форм кислорода и окислительный
стресс
Окислительный стресс в эндотелии может быть вызван избытком перекисных соединений азота. Однако это вовсе не единственный оксидант для эндотелия. В развитии механизмов окислительного стресса участвуют активные формы кислорода: радикалы кислорода - супероксид (О ), гидроксил-радикал (•ОН), пероксилрадикал (RO2’), и алкоксилрадикалы (RO'), а также некоторые молекулы, не являющиеся радикалами, однако, тоже являющиеся окислителями и/или легко превращающиеся в радикалы - такие как гипохлорид (НОС1),