Механизм регуляции активности фактора транскрипции TnrA - основного регулятора азотного метаболизма Bacillus subtilis

• Автор: Федорова, Ксения Павловна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Азотный обмен в клетках бактерий
1.2 Белки азотного обмена Bacillus subtilis
1.2.1 Нитрат- и нитритредуктазы
1.2.2 Глутаматсинтаза и глутаминсинтетаза
1.2.3 Белки AmtB и GlnK
1.2.4 Фактор транскрипции ТпгА
1.3 Регуляция генов белков азотного метаболизма с участием факторов
транскрипции TnrA, GlnR, CodY, GltC
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Активность и локализация фактора транскрипции Тпг А в условиях избытка или недостатка восстановленного азота
3.1.1 Активность фактора транскрипции ТпгА в штаммах, мутантных
по белкам GS, GlnK и AmtB
3.1.2 Исследование локализации фактора транскрипции ТпгА в зависимости от доступности азота
3.2 Идентификация домена сигнальной трансдукции фактора транскрипции ТпгА
3.2.1 Получение факторов транскрипции ТпгА с делециями С-концевого домена
3.2.2 Изучение влияния С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА на активность ДНК-связывающего домена
3.2.3 Определение участков С-концевого домена ТпгА, ответственных
за взаимодействие с регуляторными белками GS и GlnK

3.2.4 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с GlnK и

3.2.5 Исследование конкурентного взаимодействия GlnK и GS с ТпгА
в условиях in vitro
3.2.6 Изучение влияния белков GlnK и GS на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции ТпгА в условиях in vitro
3.3 Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности глутаминсинтетазы в клетках Bacillus subtilis
3.3.1 Исследование влияния фактора транскрипции ТпгА на активность GS в условиях in vitro
3.3.2 Изучение участия фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности GS в условиях in vivo
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Активность и локализация фактора транскрипции ТпгА в условиях избытка или недостатка восстановленного азота
4.2 Идентификация домена сигнальной трансдукции фактора транскрипции ТпгА
4.3 Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности глутаминсинтетазы в клетках Bacillus subtilis
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Бактерии в ходе эволюции выработали сложные механизмы адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды и способны использовать широкий спектр источников питания. Общие принципы регуляции метаболизма клеток универсальны, поэтому большинство биохимических процессов, задействованных в процессах реализации генетической информации и поддержания клеточного гомеостаза высоко консервативны. Понимание молекулярно-генетических механизмов адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям актуально как для разработки новых принципов подавления роста и размножения патогенных бактерий, так и для повышения продуктивности и жизнеспособности промышленно значимых бактерий.
Азот является одним из важнейших макроэлементов, участвующих в построении клеток живых организмов и составляет до 10% сухого вещества клетки. В природных экосистемах азот встречается в окисленной, восстановленной и молекулярной формах, но в конструктивном клеточном метаболизме азот используется только в восстановленной форме в виде аминогрупп. Соли аммония, мочевина, органические соединения (аминокислоты или пептиды) являются наиболее предпочтительными и легко усваиваемыми источниками азота для клеток. Однако многие микроорганизмы способны потреблять и окисленные формы азота в виде нитратов и нитритов. В анаэробных условиях некоторые микроорганизмы способны использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов, восстанавливая его до нитрита и газообразных форм азота (N20, N0, N2) в процессе диссимиляционной нитратредукции. Наряду с большинством растений многие бактерии используют окисленный азот для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов. Этот процесс протекает как в аэробных, так и в анаэробных условиях, сопровождается затратами клеточной энергии и получил название ассимиляционной нитратредукции.
Условия дефицита источника восстановленного азота являются неблагоприятными для роста и развития микроорганизмов. При низком

инкубировали при температуре -20°С в течение 20-30 мин. Смесь центрифугировали на холоду при 13 тыс. об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли 0.6 объема (540 мкл) изопропанола и инкубировали в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 10 тыс. об/мин. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали при 65°С и ресуспендировали в 200 мкл дистиллированной воды. К раствору добавляли 100 мкл ацетата аммония и инкубировали в морозильнике в течение 40-60 мин. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 13 тыс. об/мин. К супернатанту добавляли 0.6 объема изопропанола (200 мкл) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 10 тыс. об/мин. Осадок промывали 2-3 раза 70% этанолом и один раз 96% этанолом, просушивали и ресуспендировали в 20 мкл дистиллированной воды.
2.11 Трансформация клеток Е.соИ
Получение компетентных клеток: 1 колонию с чашки переносили в 2 мл ЬВ и инкубировали в течение ночи при 37°С на качалке со скоростью 200 об/мин. 100 мкл ночной культуры переносили в 10 мл среды ЬВ, выращивали до ОПбоо=0.6 при 37°С на качалке со скоростью 200 об/мин. Клетки центрифугировали в стерильных эппендорфах в течение 6-7 мин при 13 тыс. об/мин. Далее клетки ресуспендировали в 200 мкл стерильного раствора 0.1М СаСЬ, помещали в лёд на 2 ч при температуре 4°С.
Трансформация: к 200 мкл компетентных клеток добавляли ДНК (10 мкг) и ставили в лёд на 20 мин. Затем клетки помещали в водяную баню при температуре 42°С в течение 3-5 мин. Далее ставили в лёд на 10 мин, добавляли 800 мкл тёплого ЬВ и инкубировали 1 ч при 37°С без качания. Рассевапи на Ь-агар по 300-400 мкл с соответствующим антибиотиком.