Электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованной алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей для определения содержания низших спиртов

• Автор: Зайцев, Максим Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Методы определения содержания низших спиртов
1.2. Общая концепция биосенсоров
1.3. Метилотрофные дрожжи как биокатализаторы окисления спиртов
1.4. Биосенсоры на основе микробных клеток для определения спиртов
1.5. Ферментативные методы анализа метанола и этанола
1.5.1. Биохимические методы определения спиртов
1.5.2. Ферментные биосенсоры с электрохимическим принципом детекции
1.5.3. Биосенсоры с оптическим принципом регистрации сигнала
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Дрожжевые штаммы
2.2. Условия культивирования
2.3. Индукция дрожжей на метаноле
2.4. Изучение роста метилотрофных дрожжей
2.5. Выделение фермента АО из метилотрофных дрожжей
2.5.1. Разрушение клеток
2.5.2. Ступенчатое высаливание
2.5.3. Анионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе
2.5.4. Концентрирование АО
2.6. Активность алкогольоксидазы
2.7. Концентрация белка
2.8. Иммобилизация биоматериала
2.8.1. Иммобилизация АО с использованием бензохинона
2.8.2. Иммобилизация АО с использованием ДЭАЭ-декстрана
2.8.3. Иммобилизация дрожжевых клеток адсорбцией на стекловолоконные фильтры ОБ/А
2.8.4. Иммобилизация микроорганизмов с использованием ДЭАЭ-декстрана на нитроцеллюлозной мембране
2.9. Биосенсорный АНАЛИЗ
2.9.1. Кюветный формат проведения биосенсорного анализа
2.9.2. Проточно - инжекционный формат проведения биосенсорного анализа
2.10. Хроматографическое определение содержания спиртов
2.11. Моделирование процесса спиртового брожения
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Биотехнологические аспекты получения биомассы
метилотрофных дрожжей для выделения алкоголъоксидазы

3.1.1. Выделение алкоголъоксидазы из метилотрофных дрожжей
3.1.1.1. Очистка препарата АО с использованием ионообменной
хроматографии
3.2. Выбор способа иммобилизации алкогольоксидазы при разработке
БИОРАСПОЗНАЮЩИХ ЭЛЕМЕНТОВ БИОСЕНСОРА
3.3. Аналитические и метрологические характеристики биосенсоров на основе алкогольоксидазы
3.3.1. Характеристики биосенсора на основе алкогольоксидазы в проточно-инжекционном формате анализа
3.3.1.1. pH рабочего буферного раствора
3.3.1.2. Операционная стабильность биорецепторных элементов биосенсора проточно-инжекционного типа
3.3.1.3. Долговременная стабильность биорецептора
3.3.1.4. Градуировочные зависимости биосенсора с биорецептором на основе алкогольоксидазы
3.3.2. Сравнительный анализ функционирования биорецепторных элементов на основе выделенных дрожжевых алкоголъоксидаз коммерчески доступных препаратов
3.3.3. Влияние формата проведения анализа на селективность биосенсорного определения низкомолекулярных спиртов
3.4. Характеристики биосенсора на основе иммобилизованных метилотрофных дрожжей
3.4.1. Выбор штамма метилотрофных дрожжей для разработки микробного биосенсора
3.4.2. Аналитические характеристики биосенсора с рецепторным элементом на основе метилотрофных дрожжей, адсорбированных на стекловолоконном фильтре
3.4.3. Биосенсор с рецепторным элементом на основе метилотрофных дрожжей, иммобилизованных с использованием ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллюлозной мембране
3.4.4. Иммобилизация с использованием ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллюлозной мембране
3.4.5. Субстратная специфичность метилотрофных дрожжей, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране
3.4.6. Градуировочные зависимости сенсора для определения содержания метанола и этанола
3.4.7. Долговременная стабильность биорецептора на основе клеток, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

3.5. Определение содержания этилового спирта в коммерческих
ОБРАЗЦАХ АЛКОГОЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗРАБОТАННЫХ БИОСЕНСОРНЫХ СИСТЕМ
3.6. Определение содержания этилового спирта в полупродуктах ПРОЦЕССА СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
БЛАГОДАРНОСТИ

один люминесцентный метод определения количества образующегося в результате алкогольоксидазного окисления спирта пероксида водорода по реакции с люминалом, катализируемой K3Fe(CN)6. Метод применен в проточно-инжекционном анализе для определения 3-700 мкМ этанола в винах [108].
Наиболее часто пероксид водорода определяют спектрофотометрически в видимой области, для чего используют сопряженную биферментную систему алкогольоксидаза -пероксидаза. Предложены разные колориметрические варианты алкогольоксидазно-пероксидазного определения этанола, которые основываются на фотометрировании окрашенного продукта, генерируемого в пероксидазной реакции окисления ABTS (2,2’-азинобис-3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты), смеси 4-аминоантипирина (ААП) с 4-оксибензолсульфонатом или смеси АПП с фенолом под действием пероксида водорода, образованного в алкогольоксидазной реакции [109]:

сн3сн2он + о2 ► сн3сно + н2о2 (14)
Пероксидаза
ABTS-2Hbocct + Н202 ABTS0KlicJ1 + 2Н
В сопряженной системе во второй реакции пероксидаза катализирует окисление пероксидом водорода, образующимся в первой реакции при алкогольоксидазном окислении спиртов, различных органических соединений (хромогенов), которые служат индикаторными веществами для наблюдения за скоростью процесса. В качестве хромогенов при определении спиртов используют различные вещества.
Авторы [109] для определения метанола предлагают использовать в качестве хромогенов 2,2’-азинобис-3-этилбензтиазолин-6-сульфокислоту (АБТС) или о-дианизи-дин, причем с АБТС ими достигнут более низкий предел обнаружения метанола - 0.01 мМ. Определению не мешают диолы и вторичные спирты.
Используя в качестве хромогена о-дианизидин и учитывая различия в кинетике алкогольоксидазного окисления низших алифатических спиртов, авторы [110] разработали методику определения 0.05-0.5 М(2-20 об. %) метанола на фоне 20- и 40-об. % этанола в водных растворах и спиртных напитках. Определение метанола на фоне этанола возможно вследствие более высокой активности алкогольоксидазы при окислении метанола.
Оптический принцип детекции кислорода использован в работе [111]. Биосенсор для детекции спиртов в органической фазе был основан на АО, пероксидазе хрена и оптическом кислородном преобразователе. Ферменты совместно иммобилизовали в губковидный гидрогелевый матрикс на основе гидроксоэтилкарбоксиметилцеллюлозе,