Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина

• Автор: Матвеева, Жанна Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Содержание

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Генетические особенности вируса бешенства и молекулярно-генетические методы количественной оценки содержания вирусов, применяемые в вирусологии
1.2. Биотехнологические аспекты культивирования фиксированного вируса бешенства in vivo и in vitro
1.3.Технологические приёмы инактивации, очистки и концентрирования вируса
бешенства
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Вирусные и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточная линия Vero
2.1.3. Реактивы, растворы и питательные среды
2.1.4. Экспериментальные животные
2.1.5. Приборы и оборудование
2.1.6. Вирусные антигены
2.2 . Методы
2.2.1. Культивирование клеток Vero и вируса бешенства штамма «Москва 3253»
2.2.2. Инактивация вируса бешенства штамма «Москва 3253»
2.2.3. Концентрирование вируса бешенства штамма «Москва 3253»
2.2.4. Выделение РНК и реакция обратной транскрипции
2.2.5. Полимеразная цепная реакция
2.2.6. Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGem-T
2.2.6.1. Очистка ампликонов
2.2.6.2. Клонирование в вектор pGem-T
2.2.6.3. Культивирование рекомбинантного штамма E. coli TG
2.2.6.4. Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма
E. coli TGI pRVMoscoW3253G-L
2.2.7. Секвенирование фрагментов кДНК вируса бешенства штамма «Москва 3253»
2.2.8. Определение количества ДНК
2.2.9. Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей

2.2.10. Методы выделения антирабического гамма-глобулина и контроля
его физико-химических и биологических свойств
2.2.11. Статистическая обработка результатов исследований
Глава 3. Экспериментальное обоснование технологических параметров культивирования производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в культуре перевиваемой линии Vero
3.1. Адаптация virus fixe к перевиваемой линии Vero стационарным способом
3.2. Культивирование virus fixe в культуре клеток перевиваемой линии Vero суспензионным способом
3.3. Культивирование virus fixe в культуре клеток перевиваемой линии Vero
псевдосуспензионным способом
Глава 4. Разработка способа количественного определения фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в рабическом антигене методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов
4.1. Разработка количественной ПЦР для определения содержания вируса бешенства «Москва 3253» в антигенном материале
4.1.1. Подбор ДНК-мишени
4.1.2. Подбор праймеров и зонда
4.1.3. Конструирование рекомбинантного штамма
4.1.4. Разработка и оптимизация условий количественной ПЦР с учётом результатов в
режиме реального времени
4.2. Оптимизация количественной ПЦР с учётом результатов в режиме реального времени для определения содержания вируса
4.2.1. Оптимизация выделения РНК
4.2.2. Оптимизация условий реакции обратной транскрипции
4.3. Апробация разработанного метода при исследовании вируссодержащего
материала
Глава 5. Совершенствование технологии инактивации, концентрирования и очистки культурального вируса бешенства
5.1. Инактивация вирусного урожая
5.2. Концентрирование и очистка вирусного урожая
Глава 6. Получение сывороток от продуцентов, иммунизированных
культуральным антигеном, и выделение специфического иммуноглобулина
6.1. Получение кроличьих антирабических сывороток и исследование их
основных физико-химических и биологических показателей
6.2. Получение антирабических сывороток из крови лошади и исследование
их основных физико-химических и биологических показателей
6.3. Получение антирабического иммуноглобулина из сывороток крови продуцентов
и изучение его биологических и физико-химических показателей
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Концентрат инактивированной культуральной жидкости, очищенной от балластных примесей, в дальнейшем использовали как культуральный рабический антиген для последующих экспериментов по иммунизации животных.
2.2.4. Выделение РНК и реакция обратной транскрипции
Для выделения РНК вируса бешенства «Москва 3253» из органо-тканевого антигена и культуральной вируссодержащей жидкости использовали метод нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоцианата.
Особенности выделения РНК из органо-тканевого и культурального антигена отражены в соответствующих разделах диссертационной работы.
Для постановки реакции обратной транскрипции использовали метод получения комплементарной ДНК (кДНК) на матрице РНК с использованием обратной транскриптазы М-МТУ, которая является РНК-зависимой ДНК полимеразой, обладающей как РНК-, так и ДНК-полимеразной активностью [97].
2.2.5. Полимеразная цепная реакция
Для проведения ПЦР использовали следующие ингредиенты: Н20- деионизованная стерильная вода: минеральное масло; 1 Ох Б - 10-кратный буферный раствор; MgCl2-50 или 25 мМоль раствора хлорида магния; дНТФ - водный раствор дезоксинуклеотид-трифосфатов в концентрации 25 мМоль каждый; фермент Тп^-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза в буферном растворе, выделенная из штамма Лгеппш адиайсив У'Г-1 в концентрации 5 ед/мкл; контрольная кДНК - водный раствор кДНК: праймеры - водный раствор олигонуклеотидов; зонд формата Taq-Man - водный раствор олигонуклеотида с флуоресцентными метками.
Праймеры и зонд синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК «АБМ-800» (ТОО «Биоссет». Россия).
Концентрацию праймеров и температуру отжига рассчитывали по следующим формулам:
100 х А
V.,,- = . (1)
1.Э-1 X пА 4-0. эх г, С 4- 1.1 * Лб 4- 0.92 X пТ
где А260 - коэффициент поглощения при длине волны 260 нм;