Тканеспецифические мембранотропные биорегуляторы, выделенные из печени и легкого млекопитающих

• Автор: Мальцев, Дмитрий Игоревич
• Шифр специальности: 03.01.02, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 с. : ил.

Оглавление
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1 Строение печени, легкого позвоночных: анатомия, клеточный состав
1.1.1 Строение печени позвоночных
1.1.2 Строение легкого позвоночных
1.2 Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические 27 биорегуляторы
1.3 Биологическая активность МГТБ
1.4 Физико-химические свойства и строение МГТБ
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Получение тканевых экстрактов
2.2 Получение супернатантов тканевых экстрактов
2.3 Определение концентрации белка
2.4 Определение мембранотропной активности при кратковременном 60 органном культивировании печени и легкого мыши in vitro
2.5 Электрофорез белковых фракций в полиакриламидном геле
2.6 Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле
2.7 Определение вторичной структуры с помощью метода кругового 64 дихроизма
2.8 Определение размеров частиц методом динамического лазерного 65 светорассеяния
2.9 Обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
2.10 Роллерное органотипическое культивирование печени тритона in 66 vitro
2.11 Приготовление гистологических срезов
2.12 Методы иммунохимического анализа
2.13 Окрашивание на клеточную гибель методом TUNEL
2.14 Морфометрическая оценка гистологических срезов
2.15 MALD1 —ТОГ масс-спектрометрический анализ
Глава 3 Результаты и их обсуждение
3.1 Получение тканевых экстрактов, содержащих биорегуляторы, 70 отдельных их фракций; исследование мембранотропной активности.
3.2 Исследование биологической активности образцов "фракция 95 осадкасупернатант экстракта ткани"
3.3 Изучение состава и структуры биорегуляторов, выделенных из 98 тканей млекопитающих.
3.4 Исследование биологической активности экстрактов и отдельных их 115 фракций на модели роллерной органотипической культуры печени
тритона in vitro
Заключение
Выводы
Список литературы

Введение
Актуальность работы
Изучение различных биорегуляторов является чрезвычайно важной задачей современной биологии, в том числе биофизики. Большой интерес для исследователей представляют так называемые мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы (МГТБ), обнаруженные в животных, растительных тканях, в микроскопических грибах. МГТБ в сверхмалых дозах (СМД) влияют на важнейшие биологические процессы (адгезия, миграция, пролиферация, дифференцировка клеток, биосинтез и тд.) и по сути должны обеспечивать состояние органо-тканевого гомеостаза. На их основе разработаны фармакологические препараты нового поколения.
Ранее было показано, что МГТБ присутствуют в различных тканях млекопитающих, в том числе, в тканях печени и легкого. Показано, что биорегуляторы данной группы локализованы в межклеточном пространстве и проявляют мембранотропное действие - изменяют вязкоупругие свойства и проницаемость плазматической мембраны клеток. Биорегуляторы были объединены в отдельную группу на основании сходства их физикохимических свойств и характера биологического действия. МГТБ присутствуют в растворах в виде наноразмерных частиц, содержащих белки, углеводы, липиды. Показано, что белковая компонента ответственна за проявление МГТБ биологической активности, причем основную роль в этом играют небольшие пептиды молекулярной массой не более 6 кДа. Было показано, что действие данных биорегуляторов носит тканеспецифический характер: биорегуляторы влияют на биологические процессы только в ткани - источнике их выделения. Однако молекулярные основы тканевой специфичности до сих пор остаются мало изученными.

Цель работы
Целью данного исследования являлось изучение тканевой специфичности действия биорегуляторов, выделенных из тканей печени и легкого млекопитающих.
В отдельные задачи исследования входило:
• получить фракции, содержащие биорегуляторы тканей печени и легкого млекопитающих;
• изучить тканевую специфичность биологического действия
отдельных фракций биорегуляторов, выделенных печени и легкого, на двух экспериментальных моделях in vitro: определения мембранотропной
активности и роллерного органотипического культивирования печени тритона Pleurodeles waltl;
• изучить методами электрофореза, обращенно-фазовой ВЭЖХ и масс-спектрометрии состав отдельных фракций МГТБ;
• исследовать белки-модуляторы, входящие в состав МГТБ, выделенных из тканей печени и легкого крыс;
• изучить методами иммуногистохимии состояние печени тритона до и после действия биорегуляторов;
• изучить влияние лекарственных веществ, проявляющих гепатопротекторные свойства, на модели роллерного органотипического культивирования печени тритона Pleurodeles waltl in vitro.
Научная новизна
Показано, что в тканях печени, легкого млекопитающих присутствуют биорегуляторы, белковой природы, имеющие сложное строение, биологическое действие которых проявляется в СМД и характеризуется наличием тканевой, но не видовой специфичности. Биорегуляторы могут быть выделены как из свежеприготовленной ткани, так и из ткани, предварительно подвергшейся замораживанию. Показана тканевая специфичность мембранотропной активности фракций биорегуляторов, выделенных из печени, легкого и тонкого кишечника. Впервые показано, что
взрослых особей. Рассмотрение проблем, возникших при разработке методов, позволяющих оценивать клеточную адгезию, будет представлено в следующем разделе.
Новый подход в исследовании адгезии клеток тканей млекопитающих был осуществлен Маленковым и Модяновой (1970, 1973). Ими были подобраны условия выделения АБ из ткани печени мыши. Для этого было предложено проводить перфузию печени бескальциевым раствором при 20-37 °С, что приводило к расхождению контактирующих клеточных
поверхностей и разрушению специализированных структур контакта клеток [Маленков, Модянова, 1970, 1973]. С помощью модифицированного метода Coman, было показано, что сцепление клеток при этом уменьшалось в несколько раз и из ткани легко выделялись отдельные клетки. Добавление ионов кальция в перфузионный раствор препятствовало ослаблению сцепления и расхождению клеток. Поддержание прочности сцепления клеток является специфическим свойством ионов кальция [Модянова, 1974]. Было установлено, что при длительном перфузировании печени бескальциевым раствором, происходит вымывание высокомолекулярного вещества, которое наравне с ионами кальция оказывало влияние на межклеточные взаимодействия [Modjanova, Malenkov, 1973]. Изучение веществ, присутствующих в перфузате, показало, что они тканеспецифично влияют на адгезию клеток. В дальнейшем, полученные результаты позволили разработать новый экспериментальный подход к изучению биологических и физико-химических свойств веществ, участвующих в клеточной адгезии. [Ямскова, Модянова. 1977]. Процедура получения адгезивных белков, посредством перфузии органа была заменена экстракцией ткани физиологическим раствором. Полученный экстракт далее фракционировали с помощью различных биохимических методов. Изоэлектрофокусированием в градиенте сахарозы удалось получить адгезионный белок, активный в СМД [Ямскова В.П., Модянова Е.А. и др., 1977]. Данный белок печени характеризовался значением изоэлектрической точки в области pH 6,8-7,2.