Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков и их использование для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии

• Автор: Горященко, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Используемые сокращения
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Структура цветных флуоресцентных белков
2.2. Фотоактивируемые флуоресцентные белки
2.3. Влияние pH на спектральные свойства флуоресцентных
белков
2.4. Влияние окружения хромофора на разгорание
фотоактивируемых флуоресцентных белков
2.5. Олигомеризация цветных флуоресцентных белков
2.6. Флуоресцентный резонансный перенос энергии
2.7. Выбор FRET-пары
2.8. Определение эффективности FRET
2.8.1. Спектральные методы
2.8.2. Методы, основанные на измерении времени жизни флуоресцен ции
2.9. Биосенсоры на основе флуоресцентных белков
2.9.1. Используемые FRET-пары
2.9.2. Применение FRET-биосенсоров на основе флуоресцентных белков
2.10. Постановка цели работы
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Оборудование

3.2. Реактивы
3.3. Использованные методы
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Анализ специфичности гидролиза
сенсора Та§КЕР-23-КЕР
4.2. Определение эффективности гидролиза сенсора
TagREP-23-KFP под действием каспазы
4.3. Характеристика клеточной линии В16-ТН23К
4.4. Свойства КЕР в кислой области pH
4.4.1. Спектрально-флуоремцентные свойства КРР
в кислой области pH
4.4.2. Изучение кинетического изотопного эффекта
4.4.3. Кинетики разгоранил и тушения флуоресценции КРР
4.5. Свойства белка К ГР с заменой в148Х
4.5.1. Определение размеров хромопротеина KFP-G148N
4.5.2. Кинетикиразгорания и тушения флуоресценции КРР-в148М
4.5.3. Спектральные свойства белка КРР-а48М
4.6. Изучение экспрессии сенсора ТВ-23-С
4.7. Свойства сенсора РивнтКесМЛпкегЬНейшЬка
4.7.1. Определение размеров сенсора РгшопКеб-ЫпкаТ-Вейткка
4.7.2. Определение эффективности переноса энергии РгтопНеб в сенсоре Ри$’10п1{еЛ-Ыпке11-Ое11и$Нка
4.7.3. Спектральные свойства выделенной конструкции
4.7.4. Определение эффективности расщепления сенсора Ри$іопІІе(1-Ьіпкег1-Ое(Іткка под действием каспазы
5. ВЫВОДЫ
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

FRAP акцептора (YFP) FRAP донора (CFP)
F ” °
° Время (сек)
Рисунок 16. Метод FRAP. (А) Принцип метода FRAP. (Б) Флуоресценция донора (CFP) и акцептора (YFP) в живых клетках до и после фотообесцвечивания акцептора. (В) Получаемые зависимости флуоресценции донора и акцептора. Рисунок взят из работы [97],
Вариант iFRAP (Inverse FRAP) использует те же принципы, но в отличие от FRAP облучают всю клетку кроме небольшого участка и регистрируют уменьшение интенсивности флуоресценции данного участка с течением времени в результате диффузии в обесцвеченную область [24]. Эти методы не требуют жесткого соблюдения эквимолярности концентраций донора и акцептора и позволяют определять подвижность целевых белков и их коэффициент диффузии.
2.8.2. Методы, основанные на измерении времени жизни флуоресценции
FRET приводит к снижению времени жизни флуоресценции донора.
Эффективность переноса энергии в этом случае вычисляется по формуле