Влияние цитозинового металирования ДНК на биосинтез резвератрола в клеточной культуре винограда амурского Vitis amurensis Rupr

• Автор: Тюнин, Алексей Петрович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 109 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Резвератрол и другие стильбены растений
1.2. Биосинтез резвератрола в клетках растений
1.3. Биологически-активные свойства резвератрола
1.4. Регуляция биосинтеза резвератрола
1.5. Биотехнологические методы получения резвератрола
1.6. Цитозиновое метилирование ДНК
1.7. Биологическая значимость цитозинового метилирования ДНК и гистонов у растений
1.8. Цитозиновые метилтрансферазы растений
1.9. Деметилирование ДНК в клетках растений
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Растительный материал и культура клеток У. атигетй
2.2. Питательная среда для пассирования клеточной культуры
2.3. Выделение ДНК
2.4. Обработка метилчувствителыюй рестриктазой
2.5. Реакция бисульфитной конверсии
2.6. Выделение РНК и получение кДНК
2.7. Анализ общей экспрессии генов УаМе1, УаСМТ, Уа13КМ, УаОет с помощью вырожденных праймеров
2.8. Секвенирование ДНК и анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
2.9. Количественный анализ экспрессии генов УаММ, УаСМТ, УаЖМ, УаОет, го!В, УаБТБ с помощью ПЦР РВ
2.9. Определение содержания стильбенов в культурах клеток V. атигет'м
2.10. Статистическая обработка полученных результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Стабильность биосинтеза резвератрола в трансгенных клеточных линиях винограда V атигеп

3.2. Влияние деметилирования ДНК, вызванного с помощью 5-азацитидина (5А), на биосинтез резвератрола и экспрессию генов стильбен синтаз (STS) в культуре клеток винограда V amurensis
3.3. Экспрессия метилтрансфераз в культуре клеток винограда V. amurensis
3.4. Влияние 5А и СК на метилирование генов VaSTSl, VaSTS2 и VaSTSlO
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
5А - 5-азацитидин
БАВ - биологически активные вещества
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
ОТ-ПЦР - обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция
СК - салициловая кислота
С.О. - стандартная ошибка измерений
4CL — кумарат-КоА-4-лигаза
С4Н - циннамат-4-гидроксилаза
CHS - халкон синтаза
PAL — фенилаланин-аммиак-лиаза
РМТ - пиносильвин-О-метилтрансфераза
Phe - фенилаланин
STS — стильбен синтаза

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Растительный материал и культура клеток V. amurensis
Дикорастущие растения винограда амурского V. amurensis Rupr. (Vitaceae) были собраны на Дальнем Востоке (юг Приморского края), видовая принадлежность определена в лаборатории геоботаники Биологопочвенного института ДВО РАН. Каллусная культура V2 получена в 2002 году из молодых стеблей взрослых растений. Так же в работе использовали трансгенные культуры клеток с разными параметрами роста клеток и накопления резвератрола.
Клеточная линия W была получена в результате обработки клеток V2 V. amurensis штаммом A. tumefaciens GV3101/pPCV002 (Kiselev et al., 2007). В составе Т-ДНК вышеназванного бинарного вектора присутствует только селективный маркер nptll (ген устойчивости к канамицину, неомицин фосфотрансфераза). Каллусы представляли собой рыхлую активно растущую гомогенную ткань, не проявляющую тенденции к дифференциации. Каллусы имели характерную светло-желтую окраску и обладали схожими с родительской культурой V2 морфологическими, ростовыми и биосинтетическими характеристиками (резвератрол 0.02 ± 0.01% от сухой биомассы). Это свидетельствует о том, что сам процесс трансформации не является причиной морфологических и биохимических изменений в культурах, обработанных агробактериями.
Кроме векторной клеточной культуры W, в данном исследовании была использована ro/5-трансгенная клеточная линия VB2, которая получена в результате трансформации клеток суспензионной культуры V2 штаммом A. tumefaciens GV3101, несущим бинарную векторную конструкцию pPCV002-CaMVB/pMP90RK (Spena et al., 1987), согласно ранее описанной методике (Kiselev et al., 2007). В конструкции ген rolB находится под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты CaMV (Spena et