Влияние условий культивирования на поддержание сперматогоний хряка in vitro

• Автор: Полякова, Мария Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

Содержание:
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2Л. Строение семенника и сперматогенез
2.2. Происхождение и развитие первичных половых клеток
2.3. Происхождение и развитие гоноцитов
2.4. Происхождение и развитие сперматогоний
2.5. Поддержание и размножение сперматогоний in vitro.
Роль факторов роста и микроокружения
2.6. Перспективы получения эмбриональных стволовых клеток
из СпСК сельскохозяйственных животных
2.7. Выделение и очистка сперматогоний in vitro
2.8. Способы очистки сперматогоний
2.9. Криоконсервация половых клеток сперматогенной линии
2.10. Состояние проблемы
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1.1. Подготовка животных
3.1.2. Приборы и оборудование
3.1.3. Культуральные среды, растворы и реактивы
3.1.3.1. Ростовые среды
3.1.3.2. Специальные среды и растворы
3.1.4. Культуральная посуда
3.1.5. Приготовление фидерных слоев для культивирования СпК
3.1.5.1. Культивирование клеток STO
3.1.5.2. Культивирование клеток Сертоли свиней
3.1.5.3. Культивирование ММСК
3.1.5.4. Приготовление митотически инактивированных
фидерных слоев, используя митомицин С
3.1.6. Выделение культур клеток из семенника хряка
3.1.6.1. Механический метод выделения
3.1.6.2. Ферментативный метод выделения
3.1.7. Идентификация сперматогоний типа А хряка in vitro
3.1.7.1. Идентификация СпК в культуре
3.1.7.2. Окраска на щелочную фосфатазу
3.1.7.3. Окраска клеток Сертоли
3.1.8. Сравнительный анализ экспрессии генов - маркеров
3.1.8.1. Иммуноцитохимический метод
3.1.8.2. Полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
3.1.9. Криоконсервирование и хранение клеток
3.1.10. Определение доли жизнеспособных клеток
3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.2.1. Выделение сперматогоний из семенников хряков
3.2.2. Влияние очистки на эффективность получения культур клеток, обогащенных сперматогониями типа А хряка
3.2.3. Влияние микроокружения и факторов роста на поддержание сперматогоний типа А хряка в культуре
3.2.3.1. Характеристика КС хряка
3.2.3.2. Культивирование сперматогоний хряка на фидерном слое, представленном КС - влияние GDNF
3.2.3.3. Культивирование сперматогоний хряка на фидерных слоях, представленных монослоем клеток STO и ММСК КРС
3.2.3.4. Влияние фактора, ингибирующего активность дифференцировки (DIA) на СпК хряка в культуре
3.2.4. Криоконсервация сперматогоний хряка
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Развитие методов криоконсервации для долгосрочного хранения клеток и тканей является критическим для ex situ сохранения биологического разнообразия и поддержания генетического стабильности у различных видов.
В настоящее время значительно возрос интерес к биомедицинским исследованиям по поводу бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии [assisted reproductive technologies, ART] - вот некоторые из важных особенностей клинической терапии [Bagchi et al., 2008], хотя многие проблемы остаются нерешенными. Для борьбы с бесплодием у онкологических больных, используются методики сохранения спермы, эмбрионов, зигот, или тканей яичников, что является общей практикой [Hovatta, 2003; Orwig et al., 2005], однако, методы криоконсервации, применяемые в отношении больных препубертатного возраста, должны быть улучшены с целью их повсеместного использования.
Криоконсервация ткани тестикул или клеточной суспензии может стать альтернативой сохранения фертильности для пациентов, не достигших половой зрелости, поскольку сперматогенез у них полностью не завершен. В данной области в настоящее время проводится обширное исследование [Kanatsu-Shinohara et al. 2003Ь]. Сохранение генетического потенциала путем создания банка тканей гонад также является актуальным в решении проблем репродукции животных. Оптимальные методы криоконсервации в сочетании с методами трансплантации или ксенотрансплантации также могут помочь преодолеть некоторые проблемы в биоразнообразии редких или исчезающих видов [Snedaker et al., 2004]. Экспериментальные методы генерации фертильных гамет от криоконсервированных тканей яичников или тестикул проложили путь для дальнейшего клинического использования. Поиск наиболее подходящей технологии для сохранения репродуктивных клеток и тканей является важным решением в текущем прогрессе репродуктивной науки и техники.
При этом восстанавливать сперматогенез можно, трансплантируя не только СпСК, но и КС - их нишу. Канатсу-Шинохара с соавторами [2005а]