Физиологические характеристики суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при масштабировании процесса выращивания

• Автор: Титова, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.05, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Культура растительных клеток in vitro как источник
биологически активных соединений
1.2. Глубинное культивирование растительных клеток
1.2.1. Особенности физиологического состояния растительных
клеток при глубинном культивировании
1.2.2. Вторичный метаболизм в суспензионных культурах
растительных клеток
1.3. Технологические аспекты глубинного культивирования
растительных клеток.
1.3.1. Оптимизация условий культивирования суспензионных
культур растительных клеток
1.3.1.1. Питательные среды
1.3.1.2. Физические условия (свет, температура, pH)
1.3.1.3. Плотность и возраст инокулята, частота 23 субкультивирования.
1.3.1.4. Агрегированность и вязкость суспензий
1.3.2. Особенности аппаратного глубинного культивирования
растительных клеток
1.3.2.1. Типы биореакторов
1.3.2.2. Выбор режима культивирования (периодический,
полупроточный, проточный)
1.3.2.3. Стратегия масштабирования процесса культивирования
1.4. Краткая характеристика суспензионных культур клеток
Dioscorea deltoidea Wall, Polyscias fdicifolia В. и Ранах japonicus
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение ростовых и биосинтетических характеристик суспензионных культур клеток Р./ШЫ/оИа, Р.]аротсив и
О.(1е1(ои1еа при выращивании в колбах в стандартных условиях
3.2. Изучение физиологических показателей суспензионных культур клеток Р./НШ/оИа, Р.]аротст и О.сШШбеа при выращивании в биореакторах.
3.2.1. Культивирование штаммов в периодическом режиме.
3.2.1.1. Культивирование в лабораторном барботажном биореакторе объемом 20 л.
3.2.1.2. Культивирование в биореакторе с механическим перемешиванием объемом 75 л
3.2.2. Культивирование штаммов в режиме полупротока «отьсмно-доливным» способом (многоцикличная схема)
3.2.2.1. Культивирование в лабораторном барботажном биореакторе объемом 20 л.
3.2.2.2. Культивирование в биореакторе с механическим перемешиванием объемом 75 л
3.2.2.3. Культивирование в полупромышленном барботажном биореакторе объемом 630 л
3.2.2.4. Влияние смены систем культивирования на степень агрегированности исследуемых штаммов.
3.2.2.5. Влияние смены систем культивирования на дыхательную активность исследуемых штаммов
3.3.2.6. Влияние смены систем культивирования на накотение вторичных метаболитов у штаммов-продуцентов Р]аротсш и О.с1еко1с(еа
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Культура клеток высших растений - это экспериментально созданная популяция соматических клеток, нуждающаяся в тщательнейшем изучении. Помимо теоретического интереса к исследованию поведения растительных клеток вне организма, культура клеток имеет прямое практическое значение. Известно, что в настоящее время значительное количество лекарственных препаратов создаются на базе растительного сырья. Между тем возможности их получения сильно ограничены сокращающимися ресурсами дикорастущих растений. В связи с этим культуры клеток лекарственных растений представляют собой перспективный источник биологически активных веществ для нужд косметической, фармацевтической и пищевой промышленности. (Ramachandra et al., 2002; Bourgaud et al., 2001; Collin et al., 2001) Однако успешных примеров масштабного промышленного использования клеток высших растений in vitro немного. Это связано, прежде всего, с трудностью получения штаммов-продуцентов, трудоемкостью работ по оптимизации их выращивания и, наконец, сложностью масштабирования процессов культивирования. Кроме того, известно, что культуры клеток высших растений часто характеризуются нестабильностью процессов роста и синтеза целевых вторичных метаболитов при длительном выращивании. Для решения этих проблем и создания эффективных биотехнологий на основе растительных клеток in vitro необходим комплекс как фундаментальных, так и прикладных работ, в том числе исследование общих закономерностей роста, первичного и вторичного метаболизма клеток растений in vitro; особенностей выращивания в различных системах культивирования; создание оптимальных схем промышленного выращивания. (Verpoorte et al., 2002)
Тем не менее, подобное комплексное изучение культур клеток -продуцентов биологически-активных веществ с учетом как продуктивности и индивидуальных физиологических особенностей клеток in vitro, так и

для глубинного культивирования клеток Coptis japonica, Catharanthus rosens, Dioscorea deltoidea, Nicotiana tabacum (Kurz, 1971; Kato et al., 1975 ; Wilson, Marron, 1978; Кандараков и др., 1994; Van Gulik et al., 1992; Zhao et al., 2007).
Для изучения особенностей метаболизма клеточных популяций в фазах замедления роста и стационара используют непрерывный проточный режим выращивания без удаления биомассы из биореактора. Такие системы называют закрытым по биомассе проточным культивированием или «закрытым протоком». (Перт, 1978; Chattopadhyay et al., 2002) Важная отличительная особенность режима закрытого протока заключается в необходимости непрерывной подачи питательной среды и отборе бесклеточной культуральной жидкости. В техническом плане это реализуют при помощи перистальтических насосов, простейших измерителей расхода протекающей жидкости и емкостей для слива бесклеточной культуральной жидкости и подачи питательной среды. Наиболее сложным моментом в организации этой системы выращивания является разработка конструкции непрерывного отделения биомассы от культуральной жидкости с использованием мембран и путем седиментации клеточной биомассы. За счет этих методов системы закрытого протока обладают рядом преимуществ:
- возможность непрерывного действия системы без проблем вымывания
клеток;
- иммобилизованные клетки защищены от механического воздействия;
- в системе закрытого протока повышается межклеточный контакт и клеточная дифференциация.
В то же время возможность использование этой системы для масштабного культивирования клеток-продуцентов ограничивает ряд негативных факторов:
- возможность снижения жизнеспособности клеток в результате процесса отделения от культуральной жидкости или иммобилизации (включение в гель, контакт с мембраной и т.д.);
- сложность контролирования ростовых и биосинтетических параметров клеточной популяции;