Роль кальция в митохондриальной регуляции экспрессии генов HSP104 Saccharomyces cerevisiae и HSP101 Arabidopsis thaliana

• Автор: Пятрикас, Дарья Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 162 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Белки теплового шока
2 Л Л. Классификация БТШ
2 Л .2. Регуляция синтеза БТШ
2.2. Предполагаемые регуляторы активации экспрессии генов

2.2.1. Гипотеза обратной связи
2.2.2. Генерация активных форм кислорода
2.2.3. Повышение уровня кальция в цитозоле
2.3. Митохондриальная ретроградная регуляция
2.3.1. Митохондриальная регуляция экспрессии БТШ при
тепловом стрессе
2.4. Амиодарон
2.4.1. Эффект амиодарона на дрожжи 5. сегепшае
2.4.2. Фунгицидный эффект амиодарона
2.5. Выводы из обзора литературы и формулирование цели
исследования и задач
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Объекты и условия культивирования
3.2. Температурные обработки, обработка АМД, ингибиторами и
разобщителями ЭТЦ
3.3. Определение жизнеспособности
3.3.1. Определение жизнеспособности по восстановлению

3.3.2. Определение жизнеспособности по подсчету колониеобразующих единиц

3.3.3. Определение жизнеспособности с помощью репликатора
3.4. Выделение суммарного белка
3.5. Электрофорез в ПААГе с ДДС-ТЛа
3.6. Окрашивание и обесцвечивание гелей
3.7. Вестерн-блоттинг
3.7.1. Использованные антитела
3.8. ОТ-ПЦР-анализ
3.8.1. Выделение РНК
3.8.2. Синтез кДНК
3.9. Флуоресцентная микроскопия
3.9.1. Качественная визуализация величины потенциала на
внутренней митохондриальной мембране
3.9.2. Определение жизнеспособности по окраске флуоресцентными красителями ФДА и ПИ
3.10. Метод детекции изменения уровня Са2+ в цитоплазме клеток
А. ЛаИапа с помощью флуоресцентного красителя Р1ио-4/АМ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Изучение жизнеспособности клеток при действии АМД и
высоких температур
4.1.1. Влияние АМД на жизнеспособность 5. сегетгае
4.1.2. Влияние теплового воздействия различной интенсивности
на выживаемость клеток дрожжей Б. сегеу1$1ае
4.1.3. Влияние АМД на выживаемость культуры клеток А.
ЛаНапа
4.2. Изучение влияния АМД на содержание БТШ
4.2.1. Влияние АМД на содержание БТШ в клетках дрожжей Б.
сегеу1$1ае
4.2.2. Влияние АМД на содержание и активацию экспрессии
БТШ в культуре клеток Л. ИгаИапа

4.2.3. Сравнение влияния АМД и СССР на активацию экспрессии генов БТШ в культуре клеток А. ЛаИапа
4.3. Влияние АМД на термотолерантность
4.3.1. Влияние АМД на развитие термотолерантности в клетках дрожжей Б. сегеу181ае
4.3.2. Изучение влияния СССР на индукцию синтеза БТШ и развитие термотолерантности клеток дрожжей Б. сегеу1з1ае
4.3.3. Сравнение влияния АМД и СССР на развитие термотолерантности в культуре клеток А. ЛаНапа
4.4. Изучение влияния АМД на потенциал внутренней митохондриальной мембраны
4.4.1. Изучение влияния АМД на потенциал внутренней
митохондриальной мембраны в клетках Б. сегеугяше
4.4.2. Изучение влияния АМД на потенциал внутренней
митохондриальной мембраны в клетках А. ЛаИапа
4.5. АМД как агент, индуцирующий повышение содержания ионов кальция в цитозоле
4.5.1. Влияние АМД и СССР на уровень цитозольного Са2+ в клетках И. ЖаНапа
4.6. Изучение влияния АМД на клетки Б. сегеуа(ае с отсутствием транскрипционных факторов Мзп2р/М8п4р
4.6.1. Роль транскрипционных факторов Мзп2р/М8п4р в
повышении количества Нзр104р, индуцированного обработкой АМД
4.6.2. Влияние АМД на потенциал внутренней митохондриальной мембраны в клетках дрожжей родительского типа и изогенного ему мутанта т8п2Ат$п4А
5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Механизм токсичного действия АМД на клетки дрожжей
У cerevisiae и растений А. 1НаИапа

механизмы поддержания мтДу. Молекула АТФ, синтезируемая в результате гликолиза, поступает из цитозоля в митохондрию через АТФ/АДФ транслокатор, после чего гидролизуется Б^о-АТФ синтазой. Гидролиз АТФ сопровождается выходом протонов в межмембранное пространство (Traba et al., 2009; Физикова, 2011). Очевидно, что высшие растения также могут использовать такой способ поддержания мтД|/ при нехватке кислорода (Vartapetian, Jackson, 1997).
В клетках дрожжей в случае потери митохондриальной ДНК (мтДНК) у мутантов petite гидролиз АТФ не сопровождается транспортом протонов в матрикс митохондрий. Это связано с тем, что субъединицы 6, 8 и 9 F0 фактора FiFo-АТФ синтазы кодируются мтДНК. В этих условиях поддержание потенциала происходит за счет электрогенного обмена АТФ в обмен на АДФ, поскольку свободная форма АТФ несет четыре отрицательных заряда, а АДФ - три (Физикова, 2011).
Митохондрии - один основных сайтов генерации активных форм кислорода (АФК). Согласно Bénard и Rossignol (2008) АФК генерируются в результате функционирования комплексов I, II и III. Очевидно, что уровень генерации АФК тесно связан со значением мембранного потенциала (мтД)/). Показано, что наиболее высокий уровень продукции АФК изолированными митохондриями наблюдается при истощении АДФ в присутствии достаточного количества субстрата дыхания, так называемое метаболическое состояние 4. В этом состоянии возвращения протонов в матрикс не происходит, повышается мтД|/ и ингибируется синтез АТФ. Снижение потенциала в результате действия митохондриальных ингибиторов и разобщителей (ротенона и миксотиазола) ингибировало продукцию АФК (Korshunov et al., 1997). Считается, что в физиологических условиях митохондрии производят АТФ в промежуточном положении между метаболическим состоянием 3 и состоянием 4 (Benard, Rossignol, 2008). Однако в ряде случаев генерация АФК наблюдается при ингибировании
дыхательной цепи, например антимицином (Korshunov et al., 1997).