Дивинилэфирсинтаза CYP74B16 листьев льна : обнаружение, молекулярное клонирование и свойства

• Автор: Горина, Светлана Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 161 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Оксилипины как элементы защиты и развития растения
1.2. Биосинтез оксилипинов растений
1.3. Общая характеристика цитохромов Р450
1.4. Общая характеристика ферментов семейства CYP74
1.4.1. Алленоксидсинтазы
1.4.2. Гидропероксидлиазы
1.4.3. Дивинилэфирсинтазы
1.4.4. Эпоксиалкогольсинтазы
1.5. Сравнение механизмов катализа цитохромов CYP74 и классических монооксигеназ Р450
1.6. Внутриклеточная локализация ферментов CYP74
1.7. Регуляция экспрессии генов ферментов CYP74
1.8. Лен-долгунец {Linum usitatissimum L.) как объект исследования
1.9. Постановка цели исследования
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Методы биоинформатики
2.2. Подготовка растительного материала
2.3. Выделение тотальной РНК из листьев льна-долгунца
2.4. Реакция обратной транскрипции и получение двуцепочечной

2.5. Полимеразная цепная реакция
2.5.1. Стандартные условия проведения реакции
2.5.2. Амплификация фрагментов целевых генов de novo с помощью ПЦР с вырожденными праймерами
2.5.3. Амплификация 5'- и З'-фрагментов целевых генов

2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле
2.7. Молекулярное клонирование гена LuDES
2.7.1. Молекулярное клонирование гена алленоксидсинтазы
ZmAOSl кукурузы
2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.9. Сайт-направленный мутагенез
2.10. Характеристика вектора рЕТ-32 Ek/LIC
2.11. Характеристика использованных штаммов E. coli
2.12. Хранение штаммов E. coli и рекомбинантных плазмид
2.13. Среды для культивирования бактерий
2.14. Приготовление компетентных клеток E. coli
2.15. Трансформация компетентных клеток E. coli
2.16. Индукция синтеза рекомбинантных белков
2.17. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
2.18. Выделение и очистка рекомбинантного белка
2.19. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов '
2.20. Получение гидроперекисей жирных кислот
2.21. Кинетические исследования рекомбинантной LuDES
2.22. Проведение реакций, катализируемых рекомбинантными ферментами, с гидроперекисями жирных кислот
2.23. Анализ продуктов реакций, катализируемых рекомбинантной LuDES, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.23.1. Хроматография на обращенной фазе
2.23.2. Хроматография на нормальной фазе
2.24. Спектральные исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование вырожденных праймеров для выявления генов ранее не охарактеризованных ферментов СУР74 льна-долгунца ,
3.2. Выявление и клонирование последовательностей генов ранее неохарактеризованных ферментов СУР74 льна-долгунца
3.3. Получение рекомбинантного белка СУР74В16
3.4. Исследование кинетики реакций, катализируемых рекомбинантным ферментом СУР74В16, с различными субстратами
3.5. Идентификация рекомбинантного фермента СУР74В16 льна
как дивинилэфирсинтазы нового типа
3.6. Особенности первичной структуры и функции рекомбинантной ЬиОЕ8
3.7. Сайт-направленный мутагенез рекомбинантной ЬиОЕЯ
3.8. Каталитические свойства мутантной формы ИиОЕ8 Е292С
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
а-Линоленовая кислота
I 13-Липоксигеназа
/^ч/~ч/^СООН

Моногалактозилдиацилглицерол
(МГДГ)
Хлоропласт
^СООН
Гексадвкатриеновая кислота 13- Липоксигеназа

13-ГПОТ

11-ГПГТ

Аллемоксидсинтаза
Алленоксидсинтаза
/—ч^^СООН
0 ІЗ-С

12,13-ЭОТ
НО --ОН он
Алленокседциклаза
ССГ^о»
цис-(+Ьоксофитодиеновая кислота

Ю.11-ЭОТ
Алленоксидциклаза

tC^COOH
АрабидопсидА
динор-оксофитодиеновая кислота

4 КОМАТОЭА О О 1 КОМАТОЗД о
РедуктазаЗОфДК- К]^ч=/-ч
^"Ч^/чх^СООН ** Ч--Ч^^х^соон
ОПЦ-8:
цос-(+>*ОФДК
днОФДК
ОЛЦв.КоА лигаза 1 (ОПЦЛ1) |
Редуктаза З ОФДК
ОПЦ-8:0-КоА

Ачвтил КоА оксидаза
Мулыифункциональный
ОПЦЛ1? О
ОПЦ-6:0-КоА ^--------------- <Ґ'Ч=^
ОПЦ-4:0-КоД ^ ^ -Ч-ч^СООН
ОПЦ-6:
I Ацил-тиозстераза
(+>-7-изо-жасмоновая

метилтрансфераза жасмоновой кислоты аминосинтаза жасмоновой кислоты
Пероксисома
V-Ч^соосн
Другие производные
✓соосн
Метил (+)-7-изо-жасмонат оГ
НООСх
(+)-7-изо-жасмоноил-І--изолейцин Цитозоль
Рис. 8. Биосинтез жасмоновой кислоты и ее производных. 3-оксо-2-((2Z)-пентенил)-циклопропан-1-октановая (ОПЦ-8:0), гексановая (ОПЦ-6:0), бутано-вая (ОПЦ-4:0) кислоты [Acosta, Farmer, 2010].