Регуляция экспрессии генов субъединиц A и B изоферментов сукцинатдегидрогеназы в растениях Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L.

• Автор: Селиванова, Наталия Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 148 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Характеристики сукцинатдегидрогеназной системы
1Л. Структурная организация и механизм действия СДГ
1.2. Физиологическая роль комплекса II в растениях
II. Генетическая детерминация сукцинатдегидрогеназы
2.1. Структурные особенности организации
генетического материала
2.2. Сравнительная эволюция сукцинатдегидрогеназных генов
III. Регуляторные аспекты функционирования СДГ в
живых организмах
3.1. Экспрессионная регуляция сукцинатдегидрогеназы
3.2. Эпигенетические механизмы регуляции СДГ
3.2.1. Метилирование ДНК
3.2.2. Регуляция метилирования ДНК в
эукариотических клетках
3.2.3. Срв островки
3.2.4. Регуляция экспрессии с помощью метилирования ДНК
3.3. Регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы факторами среды
3.3.1. Влияние света на СДГ растений
3.3.2. Функционирование СДГ под действием
стрессовых факторов
IV. Рецепторные системы растений
4.1. Фитохромная система
4.1.1. Структура и свойства

4.1.2. Распространение и локализация
4.2. Криптохромы
4.2.1. Структура и свойства
4.2.1. Распространение и локализация
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2 Постановка эксперимента по созданию
светового режима
2.2.3. Метод выделения фермента
2.2.4. Определение активности сукцинатдегидрогеназы
2.2.5. Определение количества белка
2.2.6. Определение изоферментного состава
сукцинатдегидрогеназы
2.2.7. Выделение ядер из листьев кукурузы
2.2.8. Определение содержания катионов кальция
2.2.9. Определение степени загрязнения фракции ядер
2.2.10. Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.11. Определение концентрации суммарной клеточной РНК
2.2.12. Получение кДНК методом обратной транскрипции
2.2.13. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
2.2.14. Проведение ПЦР в реальном времени
2.2.15. Выделение геномной ДНК
2.2.16. Модификация ДНК бисульфитом натрия
2.2.17. Анализ промоторов сукцинатдегидрогеназных генов и подбор праймеров для метил-специфичной ПЦР

2.2.18. Проведение метил-специфичной полимеразной
цепной реакции
2.2.19. Секвенирование ПЦР-продукта
2.2.20. Измерение концентрации хлорофилла
2.2.21. Статистическая обработка данных
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.3.1. Биохимические аспекты функционирования
сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе растений
2.3.1.1. Анализ активности СДГ в различных
органах растений
2.3.1.2. Исследование изоферментного состава СДГ
2.3.2. Молекулярные аспекты функционирования сукцинатдегидрогеназы в онтогенезе растений
2.3.2.1. Экстракция суммарной РНК из щитков кукурузы
2.3.2.2. Амплификация кДНК
2.3.2.3. Изменение экспрессии генов, кодирующих субъединицу А сукцинатдегидрогеназы
2.3.2.4. Изменение экспрессии генов, кодирующих субъединицу В СДГ
2.3.3. Регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы
2.3.3.1. Исследование роли метилирования промоторов в
регуляции экспрессии генов сукцинатдегидрогеназы
2.3.3.1.1. Анализ промоторов генов, кодирующих каталитический субкомплекс СДГ
2.3.3.1.2. Изменение степени метилирования промоторов генов зсікі-і и «//г/-2 субъединицы А сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян кукурузы и смене типов питания

и не находится в прямой зависимости от последовательности ДНК, его принято считать эпигенетическим механизмом регуляции экспрессии [53].
3.2.2. Регуляция метилирования ДНК в эукариотических клетках
В эукариотических клетках описаны два типа процессов нормального метилирования. Первый, это de novo метилирование, отвечающее за перераспределение метилирования во время эмбриогенеза и процессов дифференцировки, проходящих во взрослом организме [138; 155]. Недавно были описаны две человеческие метилтрансферазы DNMT3a и DNMT3b, обладающие de novo метилирующей активностью [70; 180]. Гомологичные гены были обнаружены у мыши [102]. Эксперименты по выключению этих генов показали, что и DNMT3a и DNMT3b абсолютно необходимы для de novo метилирующей активности, но не имеют эффекта на поддерживающее метилирование [79].
Второй тип метилирующей активности в эукариотических клетках называется поддерживающим метилированием и отвечает за сохранение уже имеющегося паттерна метилирования. Первоначально была описана мышиная поддерживающая метилтрансфераза DNMT1 [69]. Высоко гомологичные ферменты были обнаружены у человека [111] и курицы [112]. Функциональные исследования этого фермента показали, что поддерживающее метилирование жизненно необходимо для нормального эмбрионального развития мыши. Полный гомозиготный нок-аут мышиной метилтрансферазы DNMT1 приводит к развитию нежизнеспособного потомства [77]. В процессе репликации ДНК, DNMT1 располагается в репликационном комплексе, где узнает нормально метилированные CpG-динуклеотиды на матричной цепи ДНК, и катализирует перенос метальной группы на соответствующий цитозин дочерней цепи. Активное привлечение