Функции и механизм действия эукариотических ферментов NEIL1 и NEIL2

• Автор: Грин, Инга Ростиславовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 139 с. : ил.

Содержание
1. Список сокращений
2. Введение
3. Обзор литературы
3.1. Повреждения ДНК
3.1.1. Потеря гетероциклических оснований
3.1.2. Дезаминирование
3.1.3. Алкилирование
3.1.4. Фотохимические повреждения
3.1.5. Окислительные повреждения
3.2. Репарация ДНК
3.2.1. Реактивация
3.2.2. Эксцизионная репарация нуклеотидов
3.2.3. Репарация гетеродуплексов
3.2.4. Воссоединение негомологичных концов
3.2.5. Гомологичная рекомбинация
3.2.6. Эксцизионная репарация оснований
3.2.6.1. Общий механизм
3.2.6.2. Выбор между основными путями
3.3. ДНК-гликозилазы
3.3.1. Структурная классификация ДНК-гликозилаз
3.3.1.1. Суперсемейство Ung
3.3.1.2. Суперсемейство Nth
3.3.1.3. Суперсемейство Fpg/Nei
3.3.2. Механизм действия ДНК-гликозилаз
3.3.2.1. Узнавание поврежденного основания
3.3.2.2. Каталитический механизм
3.3.3. Модуляция активности ДНК-гликозилаз
3.4. Белки NEIL
3.4.1. Общие характеристики
3.4.2. Основные субстраты ферментов NEIL
3.4.3. Структурные особенности белка NEIL
3.4.4. Взаимодействие белков NEIL с другими белками
3.4.5. Особенности экспрессии и полиморфизмы геновNEIL
4. Материалы и методы
4.1. Реактивы
4.2. Стандартные буферы и смеси
4.3. Ферменты
4.4. Штаммы бактерий и плазмиды
4.5. Олигонуклеотиды
4.6. Получение олигонуклеотидных субстратов
4.7. Г ель-электрофорез, визуализация и обсчет результатов
4.8. Выделение белка NEIL 1 человека
4.9. Выделение белка NEIL2 человека
4.10. Определение концентрации белка
4.11. Анализ дезоксирибофосфатлиазной активности
4.12. Анализ расщепления субстратов, содержащих 8-oxoAde
4.13. Анализ расщепления субстратов, содержащих FBUra
4.14. Определение влияния АРЕХ1 и POLP на активность фермента NEIL
4.15. Реконструкция системы эксцизионной репарации оснований
4.16. Влияние ионов тяжелых металлов на активность Fpg, Nei и NEIL

4.17. Связывание ионов металлов с белком NE1L1 и ДНК
4.18. Связывание NEIL1 с ДНК в присутствии ионов тяжелых металлов
4.19. Влияние PLP на активность ДНК-гликозилаз
4.20. Анализ кинетики инактивации фермента NEIL 1 при обработке PLP
4.21. Анализ связывания ДНК ферментом NEIL2 после обработки PLP
4.22. Масс-спектрометрический анализ комплекса NEIL2-PLP
5. Результаты и обсуждение
5.1. Дезоксирибофосфатлиазная активность белков NEIL
5.2. Роль фермента NEIL1 в репарации 8-oxoAde в ДНК
5.3. Влияние ионов тяжелых металлов на активность NEIL
5.4. Ковалентная модификация белка NEIL2 пиридоксаль-5’-фосфатом
6. Заключение
7. Выводы
8. Список литературы
Список сокращений
5-fUra 5-формилурацил
5-OH-Cyt 5-гидроксицитозин
5-OH-5-mHyd 5-гидрокси-5-метилгидантоин 5-OH-mUra 5-гидроксиметилурацил 5-гидроксиурацил 8-оксоаденин
8-оксо-2’-дезоксиаденозин-5’-фосфат 8-оксо-2’-дезоксиаденозин-5'-дифосфат 8-оксо-2 ’ -дезоксиаденозпн-5 ’ -трифосфат 8-оксо-2' - дезоксигу апозии- 5 ’ -трифос фат 8-оксогуанин
2’-дезоксирибозо-5 ’ -фосфат
4.6-диамино-5-формамидош1римид1ш 2,4-диамино-6-оксо-5-формамидопиримидин гуанидиногидантоин
мотив «спираль - два поворота - спираль» (helix - 2 turns - helix)
5.6-дигидро шмин
мотив «спираль - шпилька — спираль» (helix — hairpin - helix) изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозид фрагмент Кленова ДНК-полимсразы I Е. coli
жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (liquid chromatography / mass spectrometry / mass spectrometry)
матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (matrix-assisted laser desorption/ionization) mFapyGua 2,4-днамино-6-оксо-5Л-метил-5-формамидо пиримидин
PLP пиридоксаль-5’-фосфат
PMSF фенилмстилсульфонилфторид
SDS додецилсульфат натрия
Sp спироиминодигидантоин
THF (3-гидрокситетрагидрофуранил-2)метилфосфат
ThyGly тимингликоль
5-OH-Ura
8-oxoAde
8-oxodAMP
8-oxodADP
8-oxodATP
8-oxodGTP
8-oxoGua

FapyAde
FapyGua

H2Thy

KF exo
LC/MS/MS
MALDI

Субстратная специфичность ферментов Fpg и OGG1 перекрывается почти полностью, а субстратная специфичность фермента Nei перекрывается со специфичностью ферментов Nth и NTHL1 [96]. Это особенно интересно ввиду полного отсутствия сходства первичной и третичной структур белков из суперсемейств Fpg/Nei и Nth.
3.3.2.2. Каталитический механизм
Различия между продуктами реакций, катализируемыми моно- и бифункциональными ДНК-гликозилазами, объясняются различиями в каталитическом механизме этих двух групп ферментов. С химической точки зрения, удаление гетероциклического основания с образованием АП-сайта представляет собой реакцию нуклеофильного замещения при атоме С-Г. Монофункциональные ДНК-гликозилазы катализируют эту реакцию напрямую, используя молекулу воды в качестве атакующего нуклеофила. Механизм действия монофункциональных ДНК-гликозилаз подробно изучен на примере урацил-ДНК-гликозилаз семейства 1 (Ung E. coli, UNG человека) е применением многочисленных физико-химических методов, в т.ч. рентгенострукгурного анализа, ядерыого магнитного резонанса, кинетического изотопного эффекта и компьютерного моделирования [75]. Связывание ДНК ферментом и выворачивание в его активный центр звена dUMP приводит к разрыву связи С1 ’—N1; предполагается, что разрыв может быть вызван переходом dUrd в сильно напряженную конформацию [67] или электростатическими силами, действующими на поляризованную связь CF-N1 со стороны зарядов остова ДНК, которая в комплексе с ферментом находится в характерной изломанной конформации [97]. Ушедшее основание Ura стабилизируется в активном центре фермента в виде аниона за счет образования сильной водородной связи с остатком Hisl 87 (по нумерации Ung E. coli) и электростатических взаимодействий с остатком дезоксирибозы, который существует в виде оксакарбениевого катиона и с противоположной стороны также электростатически взаимодействует с ионизированной карбоксильной группой Asp64 (Рис. 12). Остаток Asp64 также координирует и частично ионизирует связанную в активном центре молекулу НгО, тем самым значительно повышая нуклеофильность ее атома кислорода. Атака молекулой НгО по положению С Г завершает реакцию и приводит к образованию АП-сайта (Рис. 12).
Поскольку структуры активных центров ДНК-гликозилаз разных семейств суперсемейства Ung, а тем боле других суперсемейств, могут сильно отличаться друг от друга, описанный механизм, установленный для ферментов Ung, вряд ли универсален в части активации уходящей группы. Например, некоторые основания, удаляемые