Факторы и механизмы структурно-функциональных изменений поверхностного гликопротеина ВИЧ-1 gp120 в течение ВИЧ-инфекции

• Автор: Набатов, Алексей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 160 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цели и задачи исследования
1.3 Основные положения, выносимые на защиту
1.4 Научная новизна работы
1.5 Практическая ценность
1.6 Личный вклад соискателя
1.7 Форма выполнения диссертационной работы
1.8 Апробация работы
1.9 Публикации
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Свойства вируса иммунодефицита человека
2.1.1. Таксономия, строение вириопа и жизненный цикл ВИЧ.
2.1.2. Структурные белки ВИЧ-1
2.1.3. Регуляторные белки ВИЧ-1
2.2 Ген епу. Структура и функции поверхностных гликопротеинов ВИЧ-1.
2.3. Проникновение ВИЧ-1 в клетку.
2.4. Хемокины и хемокиновые рецепторы
2.5. Фенотипические характеристики изолятов ВИЧ-1. .
2.6. Патогенез ВИЧ-1.
2.6.1. Клиническая картина ВИЧ-инфекции.
2.6.2. Причины снижения концентрации Т4-лимфоцитов и возникновения иммунодефицита
2.6.2.1. ВИЧ-индуцировапиое изменение в составе Т клеток
2.6.2.2. Изменения в составе дендритных клеток
2.7. Механизмы адаптации вируса в течение индивидуальной ВИЧ-1 инфекции.
2.7.1. Механизмы, определяющие генетическую изменчивость ВИЧ
2.7.2. Компенсаторные мутации ’
2.8. Фенотипические изменения ВИЧ и их связь с патогенезом.
2.9. Роль УЗ петли в формировании фенотипа ВИЧ-1.
2.9.1. Структура УЗ петли.
2.9.2. Участие УЗ-петли во взаимодействии с рецепторами хемокинов.
2.10. Факторы определяющие изменение фенотипа ВИЧ-1
2.10.1. Уровень хемокинов и хемокиновых рецепторов
2.10.2. Гуморальный иммунный ответ на ВИЧ-1
2.10.3. Роль УЗ-петли £р 120 в.нейтрализации вируса и возможность изучения гуморального ответа на УЗ-петлю
2.11. ВИЧ-1 и дендритные клетки
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Пациенты
3.2. Доноры и донорский материал
3.3. Создание банка сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов
3.3. Вирусы
3.4. Эксперименты по моделированию вирусной адаптации
3.4. Получение флюорссцентномеченного вируса

3.5. Культивирование эукариотических клеток
3.5.1. Выделение и культивирование первичных донорских клеток
3.5.1.1. Получение мононуклеарных клеток периферической крови (МКГ1К)
3.5.1.2. Выделение CD4+ лимфоцитов
3.5.1.3. Выделение клеток Лангерганса.
3.5.1.4. Получение ДК путем искусственной дифференцировки моноцитов (МДК)
3.5.2. Культуры клеток
3.5.2.1. Клеточные линии
3.5.2.2. Получение клеток имеющих фенотип клеток Лангерганса путем искусственной дифференцировки клеточной линии
3.5.2.3. Трансфекция эукариотических клеток СЗЗА рекомбинантными плазмидами содержащими полный геном вируса, с целью получения инфекционного вируса
3.5.3. Статины и обработка клеток статинами
3.5.4. Определение вирусного антигена в культуральной жидкости.
3.5.5. Определение инфекционной дозы (ИД) ВИЧ-1.
3.5.6. Методы нейтрализации (ингибирования) вируса.
3.5.7. Определение корецепторной специфичности ВИЧ-1
3.5.8.Связывание Raji-DC-SIGN клетками ВИЧ-1
3.5.9. Вирусная репликация в присутствии RAJI-DC-SIGN клеток или ДК.
3.5.10. Ингибирование маннаном ВИЧ-1 инфекции
3.5.11. Нейтрализация ВИЧ-1 в присутствии Raji-DC-SIGN клеток
3.5.12. Перенос захваченного нейтрализованного вируса.
3.5.13. Проточная цитофлюорометрия.
3.5.13.1. Экстраклеточное окрашивание
3.5.13.2. Внутриклеточное окрашивание
3.6. Серологические методы
3.6.1. Определение RANTES в культуральной жидкости
3.6.2. Иммунотипирование ВИЧ с использованием синтетических пептидов.
3.6.2.1. Синтетические пептиды
3.6.2.2. Твердофазный иммуноферментный анализ
3.7. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
3.7.1. Методы выделения и очистки НК
3.7.1.1. Выделение ДНК из МКПК ВИЧ-инфицированных пациентов
3.7.1.2. Выделение плазмидной ДНК
3. 7.1.3. Выделение фрагментов ДПК из легкоплавкой агарозы
3. 7.1.4. Очистка ДНК между ферментативными реакциями
3. 7.1.5. Универсальное выделение нуклеиновых кислот.
3.7.2. Амплификация ВИЧ-специфичных фрагментов
3.7.2.1. Полимеразная цепная реакция
3.7.2.2. Праймеры для амтификации
3. 7.2.3. Синтез кДНК с последующей ПЦР
3.7.2.4. Определение делетированпой формы гена CCR5 у доноров крови.
3. 7.2.5. Амплификация на основе нуклеотидной последовательности РНКNucelic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
3.7.3. Анализ нуклеиновых кислот
3.7.3.1. Электрофорез препаратов ДНК
3.7.3.2. Препаративный электрофорез препаратов ДНК в легкоплавкой агарозе 6
3.7.3.3. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в неденатурирующих условиях
3.7.4. Клонирование амплифицированных ВИЧ-специфичных фрагментов
3.7.4.1. Подготовка пяазмидного вектора для ююнирования
3. 7.4.2. Подготовка амплифицированного фрагмента для клонирования

3.7.4.3. Модификация концов амплифицированиых фрагментов
3.7.4.4. Фосфорилирование концов амплифицированиых фрагментов
3.7.4.5. Лигирование
3. 7.4.6. Подготовка компетентных клеток E.coli для трансформации
3. 7.4.7. Трансформация клеток E.coli рекомбинантными плазмидами
3.7.4.8. Отбор рекомбинантных клонов
3.7.4.9. Анализ клонированных фрагментов
3.7.5. Секвеиирование фрагментов ДНК
3.7.5.1. Секвеиирование клонированных фрагментов ДНК
3.7.5.2. Прямое секвенирование амплифицированиых фрагментов ДНК
3.8. Математические методы анализа данных
3.8.1.1Методы анализа многомерных данных
3.8.2. Поиск и использование полученных ранее генетических последовательностей
3.8.3. Методы филогенетического анализа
3.8.3.1. Подготовка последовательностей для анализа
3.8.3.2. Определение генетических дистанций
3.8.3.3. Построение филогенетических деревьев
3.8.4. Анализ схожести аминокислотных последовательностей
3.8.5. Методы статистического анализа и математического моделирования
3.9. Методы микроскопии
3.9.1. Конфокальная микроскопия
3.9.1.1. Конфокальная микроскопия вирусного захвата клетками при 3 7°С. 78'
3.9.1.2. Конфокальная микроскопия захвата вируса при 4°С.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Взаимосвязь между изменениями фенотипических свойств ВИЧ-1 и гуморальных факторов иммунного ответа
4.1.1. Изучение популяционного разнообразия первичной аминокислотной последовательности УЗ-петли и основ этого разнообразия
4.1.2. Взаимосвязь между структурой УЗ-петли и специфичностью сыворотки к ней
4.1.3. Статины как средство манипуляции сети хемокин-хемокиновый рецептор при ВИЧ-инфекции.
4.1.3.1. Эффект статинов на предствленностъ CD4 и хемокиновых рецепторов на ЦПМ: Снижение представленности CCR5
4.1.3.2. Статины усиливают секрецию R/INTES CD4+ Тлимфоцитами.
4.1.3.3. Статины предпочтительнее снижают инфекцию CD4+ Тлимфоцитов вызванную R5 вирусами, чем Х4 вирусами.
4.1.4. Изменения в структуре gp 120 в течение ВИЧ-инфекции как отражение приспособляемости к иммунным гуморальных факторам.
4.1.4.1. Влияние заряда V3 петли и профиля N-гликозилирования V1V2 и V3 петель на использование того или иного хемокинового рецептора.
4.1.4.2. Низкий заряд V3 петли приводит к низкой чувствительности к RANTES.
4.1.4.3. Высокий заряд УЗ петли соответствует низкой чувствительности ВИЧ-1 к ингибированию хемокипом SDF-1 альфа.
4.1.4.4. Чувствительность к нейтрализации ВИЧ-1 зависит от профиля гликозипирования VI и УЗ доменов gpl20.
4.2. Механизмы изменений gpl20 в течение ВИЧ-инфекции
4.2.1. Механизмы восстановления функциональности дефектного по фолдингу gpl20
4.2.2. Восстановление уровня вирусной репликации
4.2.3. Чувствительность мутантов к ингибированию растворимым CD4 и AMD3100
4.2.4. Чувствительность мутантов к нейтрализации антителами b 12 и 2G12

Рисунок 2.8. Схема присутствия и появления R5 и Х4 вирусов в течение ВИЧ-1 инфекции, где: Viral load - уровень вирусной нагрузки (определяемой по присутствию ВИЧ-специфичсской РНК в крови), Transmission - момент инфицирования; CD4 count — уровень CD4 положительных клеток; AIDS - СПИД, H1V - ВИЧ, Time (yrs) - время ( в годах).По обзору Бергера с соавт. (Berger et al., 1999)
Ассоциация Х4-вариантов ВИЧ с быстрой прогрессией заболевания и их позднее появление в течение инфекции, а также постоянное присутствие R-5-вариантов на протяжении инфекции показывает, что появление Х4-вариантов коррелирует с развитием прогрессирующей иммуносупрессии.
Вопрос о том, каким вирусом происходит инфицирование до сих пор остается открытым в связи с трудностью идентификации вируса на самых ранних стадиях инфекции. Способность развивать полноценную инфекцию была показана как для R5 так и для Х4 вирусов. Тем не менее, стадии предшествующие СПИД характеризуются присутствием исключительно R5 вирусов. Это положение оказалось справедливо в том числе и для инфекций вызванных Х4 вирусами (Cornelissen et al., 1995). Это свидетельствует о том, что R5 вирусы являются необходимой стадией в развитии ВИЧ-инфекции, и именно вследствие этого гомозиготные мутации A32CCR5 приводят к практически 100% невоприимчивости к ВИЧ-1. Более того, корреляция присутствия Х4 вирусов с симптоматическими (температура и прочая) стадиями ВИЧ-инфекции в свою очередь способствует меньшей вероятности передачи Х4 вирусов хотя бы в силу меньшей подвижности индивида период этих стадий.