Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране

• Автор: Еремеев, Сергей Андреевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
1.Список сокращений
2. Введение
2.1 Актуальность работы
2.3 Задачи исследования
2.4 Научная новизна работы
2.5 Практическое значение работы
3. Обзор литературы
3.1 Строение и функции митохондрий
3.2 Структура комплексов дыхательной цепи
3.2.1 Первый дыхательный комплекс
3.2.2 Второй дыхательный комплекс
3.2.3 Третий дыхательный комплекс
3.2.4 Четвертый дыхательный комплекс
3.2.5 АТФ-синтетаза
3.3 Сопряжение процессов дыхания и фосфорилирования
3.3.1 Химическая схема сопряжения
3.3.2 Хемиосмотическая гипотеза Митчелла
3.3.3 Теория Вильямса
3.3.4 Схема Бойера
3.3.5. Фракция неравновесно связанных с поверхностью мембран протонов и ее
идентификация
3.3.6 Два режима системы сопряжения
3.3.7 Трансмембранный градиент протонов, локальный градиент активности ионов
водорода на БЛМ
3.3.8 Разобщители и разобщение
3.4 Активные формы кислорода
3.4.1 Общие сведения
3.4.2 АФК - регуляторные молекулы
3.5 Хиноны ряда Бк() и МПо()
4. Материалы и методы
4.1 Реактивы

4.2 Буферные растворы
4.2.1 Среды для экспериментов с митохондриями
4.2.2 Среды для экспериментов на БЛМ
4.2.3 Среды для спектрофотометрических экспериментов
4.3 Выделение митохондрий печени
4.4 Измерение скорости дыхания митохондрий
4.5 Измерение степени стимуляции дыхания митохондрий низкими концентрациями поверхностно активных протонофоров
4.6 Активация сукцинатдегидрогеназы
4.7 Восстановление ТРР+-конъюгированных хинонов и измерение спектральных характеристик восстановленных форм
4.8 Расчет теоретических значений
4.9 МАЫ}1 спектроскопия
4.9.1 Механизм ионизации
4.10 Эксперименты на модели бислойной липидной мембраны (БЛМ)
5. Результаты и обсуждение
Раздел 1. Поверхностно активные и протонофорные свойства ТХФ-С15
5.1.1 ТХФ-С15 детергент или протонофор (определение условий эксперимента)
5.1.2 Низкие концентрации ТХФ-С15 (1 мкМ) стимулируют дыхание митохондрий в состоянии 2 по Чансу
5.1.3 Доказательство протонофорных свойств ТХФ-С15 на модели БЛМ
5.1.4 Избирательность взаимодействия ТХФ-С15 с фракцией Я-протонов в митохондриях
5.1.5 Влияние ТХФ-С15 на величину параметра АДФ/О
5.1.6 Попытка измерения ТХФ-С)5 на величину мембранного потенциала митохондрий
Раздел II. Эндогенные транспортные системы, контролирующие функционирование ТХФ-С15 (как протонофора) в митохондриях
5.2.1 Транслокатор нуклеотидов принимает участие в транспорте ТХФ-С!5 через мембрану митохондрий
5.2.2 Переносчик фосфата в митохондриях - эндогенный регулятор объема фракции мембраносвязанных протонов
5.2.3 Заключение к разделам I и II
Раздел III. Бк(23 - сравнение с ТХФ-С15 и рассмотрение особенностей

5.3.1 Введение
5.3.2 Механизмы стимуляции дыхания митохондрий индуцированного SkQ3
5.3.3 Модель ускорения дыхания митохондрий под действием SkQ3
5.3.4 SkQ3, также как ТХФ-С15, избирательно взаимодействует с R-протонами в
митохондриях
5.3.5. Фосфат (также как и в случае ТХФ-С15) резко снижает ускорение дыхания
митохондрий под действием SkQ3
5.3.6 Заключение
Раздел VI. Дополнительные исследования (сопоставление специфических свойств ТХФ-С15 и SkQ3)
5.4.1 Изучение эффекта ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций ТХФ-С15
5.4.1.1 Введение
5.4.1.2 Разобщающее действие ТХФ-С15 в наномолярном диапазоне концентраций
5.4.2 Изучение эффекта ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций SkQ3
5.4.3 Заключение
5.4.4 Доказательство отсутствия стерических запретов для образования внутирмолекулярных циклических цвиттерионов
6. Выводы
7. Список литературы

во-вторых, то, что существуют независимые от фосфата пути превращения энергии. Эту относительно простую схему пришлось значительно усложнить после того, как была обнаружена способность митохондрий накапливать катионы, такие как Са2+. Пришлось предположить существование катионных помп, использующих энергию интермедиата. Кроме того, химическая теория не отвечала на вопрос о том, почему и как действуют разобщители дыхания и фосфорилировния митохондрий. Ведь, если принять, что разобщители действуют как аналоги фосфата, то получалась парадоксальная ситуация, что ферменты предельно неспецифичны по отношению к субстратам, что было не приемлемо. Также, новые данные о переносе протонов при дыхании привели к появлению гипотезы о первичной роли протонных помп, использующих энергию интермедиата.
3.3.2 Хемиосмотическая гипотеза Митчелла
Сейчас общепризнанной является хемиосмотическая теория сопряжения дыхания и фосфорилирования, предложенная сэром Питером Митчеллом (1). Первоначально хемиосмотическая гипотеза возникла не в связи с проблемой окислительного фосфорилирования, а в связи с механизмом активного транспорта веществ через клеточные мембраны, выяснению которого был посвящен ряд работ Митчелла. Особенно Митчелла интересовал вопрос, как ненаправленные (в пространстве) химические реакции могут вызывать направленный (векторный) перенос веществ через мембрану. Он предположил, что структура транспортных белков позволяет субстратам и продуктам проникать в активный центр и покидать его лишь по определенным путям (55).
Хемиосмотическая гипотеза первичного акта трансформации энергии окислительновосстановительных реакций содержит следующие четыре основных постулата.
1. Дыхательная и фотосинтетическая электронпереносящие цепи должны переносить протоны через мембрану. Энергозависимый перенос протонов был впервые обнаружен на препаратах разрушенных хлоропластов (56). Перенос протонов в митохондриях был впервые зарегистрирован Митчеллом и Мойл ( (57), (58), (59), (60), (61)) в опытах, где добавка небольшого количества Ог к анаэробной суспензии митохондрий вызывала закисление среды. Низкие концентрации разобщителя ускоряли спад протонного градиента после исчерпания кислорода. Было показано, что стехиометрия выброса протонов согласуется с гипотезой транслокации групп. В условиях постоянного дыхания была получена величина ДрН‘ более 200 мВ (62). Левицкий и Скулачев (63) показали, что митохондрии могут использовать протонный градиент для накопления самых различных липофильных катионов. Субмитохондриальные частицы и хроматофоры, имеющие обратную ориентацию мембран, также накапливали липофильные анионы.