Изучение свойств реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с измененным белковым окружением мономерного бактериохлорофилла BA

• Автор: Леонова, Мария Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список условных сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Краткая характеристика аноксигенных пурпурных бактерий
1.2 Структура и функции фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий
1.2Л Компоненты фотосинтетической мембраны
1.2.2 Светособирающие комплексы
1.2.3 Структура реакционного центра
1.2.4 Перенос электрона в реакционном центре
1.3 Фотосинтетический генный кластер и системы для направленного мутагенеза
1.4 Генетические модификации белка
1.4.1 Исследование симметрии комплекса реакционного центра
1.4.2 Удаление кофакторов
1.4.3 Замещение кофакторов
1.4.4 Изменение окислительно-восстановительного потенциала димера бактериохлорофиллов
1.4.5 Исследование прочного взаимодействия между молекулой БХл и
белком в мутантных РЦ
1.4.6 Модификация участка взаимодействия РЦ с цитохромом с
1.4.7 Мутации, затрагивающие молекулы воды
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Штаммы и плазмиды
2.2 Среды и буферы
2.3 Методы генной инженерии
2.3.1 Мутагенез
Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции
Получение олигонуклеотидов для направленного мутагенеза
Мутагенез с помощью «GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System»
2.3.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК из культуры Е. coli
2.3.3 Выделение суммарной ДНК из культуры Rba. sphaeroides
2.3.4 Количественное определение ДНК в образце
2.3.5 Расщепление плазмидной ДНК рестриктазами

2.3.6 Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
2.3.7 Препаративное выделение ДНК из геля
2.3.8 Лигирование вектора и фрагментов ДНК
2.3.9 Получение электрокомпетентных клеток
2.3.10 Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
2.3.11 Конъюгативный перенос плазмид из E. coli в Rba. sphaeroides
2.4 Микробиологические и биохимические методы
2.4.1 Культивирование бактериальных штаммов
2.4.2 Выделение хроматофоров
2.4.3 Выделение и очистка реакционных центров
2.4.4 Пигментный анализ РЦ и хроматофоров
2.5 Биофизические методы
2.5.1 Оптическая спектроскопия в видимой, ближней ИК и УФ области
2.5.2 Измерение спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции
2.5.3 Измерение спектров действия фотохимической активности
2.5.4 Измерение спектров кругового дихроизма
2.5.5 Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Внесение направленных аминокислотных замещений в РЦ Rba. sphaeroides
3.1.1 Получение мутантных штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в положении L153 и L
3.1.2 Получение мутантных штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями H(M182)L и H(L153)Y+H(M182)L в РЦ
3.2 Исследование изолированных мутантных реакционных центров H(L153)M,
H(L153)C
3.2.1 Спектры поглощения реакционных центров дикого типа и с аминокислотньми заменами H(L153)M и H(L153)C
3.2.2 Дифференциальные фотоиндуцированные спектры поглощения реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами H(L153)MhH(L153)C
3.2.3 Пигментный состав реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами H(L153)M и H(L153)С
3.3 Исследование мембраносвязанных мутантных реакционных центров H(L153)L, H(L153)Y и H(L153)Y+H(M182)L

3.3.1 Спектры поглощения хроматофоров Н(Ы53)М, Н(Ы53)Ь, Н(Ь153)У
и Н(1Л53)У+Н(М182)Ь и РЦ Н(М182)Ь
3.3.2 Измерение спектров кругового дихроизма мембраносвязанных РЦ
дикого типа и мутанта Н(1Л53)У+Н(М182)Ь
3.3.3 Исследование фотохимической активности мембраносвязанных РЦ
3.3.4 Пигментный анализ мембраносвязанных РЦ Н(Ь153)У
3.3.5 Фемтосекундные исследования безантенных хроматофоров дикого типа
и мутанта Н(Ъ15 3)У
3.3.6 Фемтосекундные исследования безантенных хроматофоров
Н(Ь 15 3) У+Н(М 182)Ь
3.3.7 Возможное значение аминокислотного остатка гистидина Ы53 для стабильности комплекса РЦ
3.4 Исследование свойств реакционных центров У(Ы28)Н
3.4.1 Спектры поглощения мутантных РЦ У(Ь128)Н
3.4.2 Фотохимическия активность мутантных РЦ У(1.128)
3.4.3 Фемтосекундные исследования мутантных РЦ У(Ы28)Н
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

1.4.7 Мутации, затрагивающие молекулы воды
В структуре РЦ Rba. sphaeroides, полученной с разрешением 1,87 Ä [Koepke et al., 2007], насчитывается более 400 молекул воды, сгруппированных, в основном, на пе-риплазматической или цитоплазматической стороне мембраны, но также встречающихся вблизи димера БХл и хинонов и, в единичных случаях, в центральной мембранной части РЦ [Wachtveitl et al, 1993; Gong et al., 2003; Koepke et al., 2007]. Как известно, молекулы воды полярны, способны образовывать водородные связи и донировать протоны, поэтому их появление в гидрофобной части мембранного комплекса или исчезновение из нее в результате мутации может серьезно повлиять на свойства и функционирование РЦ, хотя предсказать такие эффекты чаще всего невозможно [Jones, 2009]. Например, замещение Ser L223 на Ala или Asp в РЦ делает нефункциональным сайт QB, а замещение этого Ser на Gly не нарушает работы Qb сайта [Paddock et al., 1995], замена Glu L212 на Gin нарушает функционирование Qb, а при замещении Glu на Ala этого не происходит [Miksovska et al., 1997]. Было высказано предположение, что при замещении Ser и Glu па остатки меньшего объема в белковом кармане остается пространство, которое может занять молекула воды, способная выполнить функции этих аминокислот [Paddock et al., 1995; Miksovska et al., 1997].
Очевидно, что вода играет роль в лигандировании БХл в тех мутантных РЦ, в которых гистидины, координирующие атомы магния димера БХл Р, заменены на глицины. Несмотря на то, что глицин не может служить лигандом для атома Mg БХл, в РЦ H(L173)G и H(M202)G первичный донор представлен парой молекул БХл. Было сделано предположение, что в структуру РЦ могла встроиться молекула воды, которая и послужила пятым лигандом атома магния [Goldsmith et al., 1996]. Аналогичное предположение было выдвинуто для объяснения замещения БФео На на БХл в РЦ двойного мутанта F(L97)V+F(L121)H, в котором расположение нововведенного His L121 было неоптимально для лигандирования атома магния БХл [Heller et al., 1995Ь]. Поскольку теоретически предсказать появление или удаление воды из структуры мутантных РЦ сложно, при изучении этой проблемы представляется целесообразным сочетать спектральные измерения и рентгеноструктурные исследования [Jones, 2009].
В качестве примера влияния мутации на конкретную молекулу воды можно назвать РЦ G(M203)L Rba. sphaeroides. В этом РЦ глицин М203, расположенный между димером Р и мономерным БХл А-ветви, был замещен на лейцин, и эта мутация привела к четырехкратному замедлению скорости первичного переноса электрона от Р* к Вд при 90 К [Yakovlev et al., 2005]. Данные рентгеноструктурного анализа мутантного РЦ показали, что молекула воды, расположенная в РЦ дикого типа на расстоянии водородной связи от