Внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты крови и мочи: особенности циркуляции, выведения и использование в диагностике

• Автор: Брызгунова, Ольга Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 180 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Циркуляция дезоксирибонуклеиновых кислот в крови
1.1.1 Источники внеклеточных ДНК крови
1.1. 2 Состав циркулирующих в крови комплексов внеклеточных ДНК
1.1.3 Факторы, влияющие на циркуляцию ДНК в крови
1.2 Внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты мочи
1.2.1 Механизмы появления внеклеточных ДНК в моче
1.2.2 ДНК-гидролизующие ферменты мочи
1.3 Применение внеклеточных/циркулирующих ДНК в диагностике
1.3.1 ДНК-маркеры опухолевых клеток в состве внеклеточных ДНК крови
1.3.2 ДНК-маркеры опухолевых клеток в составе внеклеточных ДНК мочи
1.3.3 Методы исследования статуса метилирования ДНК
1.3.3.1. Выявление метилированных цитозинов без использования метилчувствительных нуклеаз рестрикции
1.3.3.2. Выявление метилированных цитозинов в составе ДНК при помощи метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции
1.3.3.3. Методы маштабного исследования метилирования геномов
1.3.4 Использование циркулирующих/внеклеточных ДНК в диагностике рака предстательной
железы
1.3.4.1. Эпидемиология онкологических заболеваний предстательной железы
1.3.4.2. Современные методы исследования онкологических заболеваний предстательной железы
1.4 Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Оборудование
2.1.3. ПЦР системы, использованные в работе

2.1.4. Клетки, используемые в работе
2.1.5. Лабораторные животные
2.1.6. Клинические характеристики здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
2.2. Методы
2.2.1. Подготовка образцов крови и мочи
2.2.1.1. Взятие образцов крови
2.2.1.2. Приготовление плазмы крови и элюатов с поверхности форменных элементов крови
2.2.1.3. Подготовка образцов мочи
2.2.2. Определение нуклеазной активности в плазме крови и моче здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
2.2.2.1. Приготовление модифицированного субстрата
2.2.2.2. Изготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена
2.2.2.3. Определение ДНКазной активности иммуноферментным анализом
2.2.3. Выделение ДНК из образцов крови и мочи
2.2.3.1.Оптимизация методов выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови и мочи
2.2.3.2. Выделение ДНК из образцов крови
2.2.3.3. Выделение ДНК из супернатанта мочи
2.2.4. Культивирование клеток линии HeLa
2.2.5. Получение лейкоцитов человека
2.2.6. Выделение РНК из мембранно-цитозольной фракции клеток линии HeLa
2.2. 7. Выделение геномной ДНК из клеток линии HeLa и лейкоцитов человека
2.2.8. Приготовление стандарта фрагментированной геномной ДНК для последующего определения концентрации внДНК в моче
2.2.9. Определение концентраций цир/внДНК в крови и моче
2.2.10. Определение концентрации простатического специфического антигена в плазме крови
2.2.11. Исследование размера и состава внНК в моче здоровых мужчин и больных с онкологическими заболеваниями предстательной железы
2.2.12. Исследование циркуляции и стабильности препаратов очищенной ДНК и ДНК плазмы крови человека in vivo
2.2.12.1. Метилирование геномной ДНК
2.2.12.2. Приготовление ПЦР-продуктов промоторной области гена GSTP
2.2.12.3. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
2.2.12.4. Оценка стабильности ДНК в сыворотке крови мыши
2.2.12.5. Эксперименты, выполненные на лабораторных мышах BALB/c
2.2.12.6. Обработка крови мыши и выделение свободной цирДНК
2.2.13. Секвенирование цир/внДНК методом Сэнгера
2.2.13.1. Приготовление [32Р] меченых олигонуклеотидов
2.2.13.2. Бисульфитная модификация ДНК
2.2.13.3. Получение ДНК промоторной области гена GSTP1 (1001-1302, Х08058) при помоши полимеразной цепной реакции
2.2.13.4. Секвенирование методом Сэнгера
2.2.14. Пиросеквенирование геномной ДНК и свободной цирДНК плазмы крови здоровых доноров и больных раком предстательной железы
2.2.14.1. Подготовка образцов ДНК
2.2.14.2. Модификация ДНК
2.2.14.3. Количественная оценка ДНК до и после модификации
2.2.14.4. Пиросеквенирование геномной и циркулирующей ДНК
2.2.15. Исследование различий в паттернах метилирования внеклеточной ДНК плазмы крови здоровых доноров и больных аденокарциномой предстательной железы при помощи микрочипов
2.2.15.1. Оптимизация методов эффективного концентрирования цирДНК
2.2.15.2. Подготовка образцов цирДНК крови для сравнительного исследования при помощи CpG island microarray
2.2.15.3. Проведение микрочипового исследования CpG island microarray
2.2.16. Статистическая обработка данных
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Разработка методических подходов к исследованию цирДНК крови и внДНК мочи
3.1.1. Измерение дезоксириббнуклеазной активности
3.1.2. Подготовка образцов цир/внДНК
3.1.3. Бисульфитная конверсия внеклеточных ДНК
3.2. Цир/внДНК крови и мочи здоровых доноров и пациентов с онкологическими заболеваниями предстательной железы
3.2.1. Определение уровня общего простатического специфического антигена (ПСА) в крови здоровых доноров и онкологических больных

цитозины полностью сульфонируются, а т5С не модифицируются, затем проводят реакцию десульфонирования в щелочных условиях, что приводит к дезаминированию цитозинов и их конверсии в урацилы (Рис. 1А).

Сульфонировоние Дезаминирование Десулыронирование NH2 NHZ О О
1 HS03‘ Л Н?0 NR,* 1 J
~ HN^N у / t ОН' ^ HN"
O^N*T 0Н O^NH^50* HS°3 O^NH
., Урацил
Цитозин

nh2 nh2 nh
HSOj- » Ї CHj I CH, I CH,
?! 5^ , HNvkV' °HA N iT
Anh^ oh 0AnhA-so3- h

Метил цитозим Метилцитозин
Рис. 1. (А) Изменения цитозина при химической конверсии в процессе обработки бисульфитом натрия; (Б) Схема метода МИББ для оценки доли метилированных цитозинов в образце ДНК [288].
Метилированный
Лмлликоны
Неметилированньгй
| Капилярный электрофорез
После этого достраивают или амплифицируют одну или обе цепи ДНК при помощи праймеров, комплементарных конвертированной ДНК (после дезаминирования неметилированных цитозинов цепи теряют комплементарность). Далее секвенируют ПЦР-продукты или клонируют ДНК и секвенируют вставки. В этом случае т5С выявляется как цитозин [286], тогда как неметилированные цитозины определяются как тимины. Среди других преимуществ метода необходимо отметить его высокую чувствительность (от 2 пг ДНК, обычно необходимое количество составляет 2 мкг [287]), точность - за счет одновременного анализа исходно комплементарных цепей и возможность исследовать статус метилирования отдельных молекул ДНК, что позволяет изучать процессы изменения метилирования специфических последовательностей в одной или нескольких клетках.
Бисульфитную модификацию можно использовать для оценки доли метилированных цитозинов в образце ДНК. Этот подход называется «methylation-dependent fragment separation, MDFS» [288] (Рис. 1Б) и заключается в амплификации ДНК после бисульфитной конверсии ДНК с использованием праймеров не зависящих от метилирования (т.е. не содержащих в своем составе CpG-динуклеотидов), один из которых мечен флуоресцеином. После амплификации ПЦР-продукты, содержащие разное количество метилированных цитозинов, разделяют при помощи денатурирующего капиллярного электрофореза за счет разного вклада цитозинов и тиминов в подвижность ДНК и оценивают соотношение метилированных и неметилированных форм по интегральной флуоресценции электрофоретических зон.