Влияние мезенхимальных стволовых клеток на восстановление периферического нерва после травмы

• Автор: Карагяур, Максим Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 с. : ил.

Список сокращений
Оглавление

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Патогенез травматических повреждений нервов
Актуальность проблемы
Краткий обзор устройства периферической нервной системы млекопитающих
Патогенез травматических повреждений нервов
Факторы, стимулирующие рост и регенерацию нервных волокон
Факторы, определяющие успешную регенерацию периферического нерва
Существующие подходы к терапии поврежденных нервов
Перспективные подходы к терапии поврежденных нервов
Мезенхимальные стволовые клетки
Характеристика мезенхимальных стволовых клеток
Роль МСК в тканях
МСК- перспективный материал для клеточной терапии и тканевой инженерии
Возможные механизмы, благодаря которым МСК стимулируют регенерацию тканей _
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные
Культура мезенхимальных стволовых клеток
Выделение тотальной РНК
Денатурирующий электрофорез РНК в агарозно-формальдегидиом геле
Транскриптомный анализ
Модель повреждения периферического нерва
Методы оценки эффективности регенерации периферического нерва
Оценка восстановления функции двигательных нервных волокон
Оценка восстановления проводимости нерва (электрофизиологическое исследование)
Оценка восстановления структуры поврежденного нерва (иммунногистохимическое
исследован не)
Оценка восстановления структуры поврежденного нерва (гистохимическое окрашивание
срезов нерва Судаковым черным)
Имплантация МСК на поврежденный нерв
Получение плазмидной конструкции для экспрессии мозгового фактора роста нервов

Выделение плазмидной конструкции рУахЫВИЖГ
Электрофорез генетической конструкции pVaxl-hBDNF в агарозном геле
Тестирование полученной нлазмидной конструкции рУах1-1|ВР^
Анализ наличия кДНК В019Г в плазмидной конструкции с помощью полимеразной
цепной реакции
Анализ эффективности экспрессии плазмидной конструкции рУах1-йВО^ в
эукариотических клетках
Иммуноферментный анализ кондиционированной среды
Доставка плазмидной конструкции рУах1-ИВР^ в мышцы
Анализ эффективности экспрессии ВБОТ в мышечных волокнах
Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МСК стимулируют функциональное и структурное восстановление поврежденного
периферического нерва
МСК экспрессируют факторы роста и компоненты матрикса, необходимые для
роста аксонов, а также компоненты миелина
Блокирующие антитела к факторам роста, продуцируемым МСК, подавляют способность МСК стимулировать восстановление функции н структуры
поврежденного периферического нерва
Оптимальный метод доставки генетических конструкций в мышечные волокна
Вектор рУахЬЬВРОТ экспрессируется в эукариотических клетках и мышечных
эксплантах
Генетическая конструкция рУахЫтВО^ содержит кДНК ЬВ1ЖГ
Генетическая конструкция рУахГИВОЖ экспрессируется в клетках линии НЕК293Т
Максимально эффективная экспрессия ЙВБЫР в мышечных волокнах может быть
достигнута инъекцией 200 мкг рУах1-ИВО№
Максимально эффективное восстановление структуры и функции поврежденного
нерва наблюдается после инъекции 200 мкг рУах1-ЬВ1ЖЕ
Генетическая конструкция рУах1-ВБ№ стимулирует восстановление функции и структуры периферического нерва после травмы
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений АТФ- аденозинтрифосфат ЖТ- жировая ткань ИФА- иммуноферментный анализ КМ- костный мозг
ММП- матриксные металлопротеиназы мВ- милливольт мс- миллисекунда
мск- мезенхимальные стволовые клетки ПНС- периферическая нервная система спдн- суммарный потенциал действия нерва цнс- центральная нервная система ЭБС- эмбриональная бычья сыворотка ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота ATIt- annexin А-2,аннексии А-2 Art- artemin, артемин
BDNF- brain-derived neurotrophic factor, мозговой фактор роста нервов CD- cluster of differentiation, кластер дифференцировки CNTF, CNTFR- Ciliary neurotrophic factor, Ciliary neurotrophic factor Receptor, ресничатый нейротрофический фактор, рецептор ресничатого нейротрофического фактора
DAPI- 4',6-diamidino-2-phenylindole, 4',6-диамидино-2-фенилиндол DCC- Deleted in Colorectal Cancer
DMEM- Dulbecco's Modified Eagle Medium, среда Игла, модифицированная Дульбекко
EGF- Epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста ELISA- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, иммуноферментный анализ erk- extracellular signal-regulated kinases, киназы, регулируемые внеклеточными сигналами

ламининовому субстрату (Muir et al., 1989; Snow and Letourneau, 1992; Snow et al., 1996). Однако механизм ингибирующего влияния протеогликанов на рост нейрита неизвестен. Предположительно, они модулируют активность макромолекул внеклеточного матрикса (фибронектина, ламинина) (Braunewell et al., 1995; Burg et al., 1996) и/или рецепторов к ним (Milev et al., 1994). В периферических нервах хондроитинсульфат ко-локализуется с ламинином в базальной мембране, и в регенерирующем нерве его экспрессия повышается вместе с экспрессией ламинина (Zuo et al., 1998b). В связи с локализацией его экспрессии в нервной ткани (в аксональных барьерах) можно предположить, что физиологической функцией хондроитинсульфата является ограничение выхода конуса роста за границы нерва (Snow et al., 1990; Oakley and Tosney, 1991; Katoh-Semba et al., 1995).
Итак, основными функциями белков внеклеточного матрикса в процессе восстановления периферического нерва являются создание поверхности для роста нейрита и миграции клеток, направление конуса роста за счет сочетания процессов аттракции и репульсии, а также специфические функции (через активацию интегриновых рецепторов).
В процесс восстановления периферического нерва свой вклад вносят и ферменты. Они способствуют росту и регенерации нервных волокон благодаря очищению соединительнотканного чехла нерва от фибрина и матриксных белков, ингибирующих рост нервных волокон. Также они способствуют высвобождению из окружающего матрикса и последующей активации факторов роста. Основными ферментами, участвующими в процессе регенерации поврежденных нервных волокон, являются урокиназный и тканевой активаторы плазминогена (иРА и tPA), плазминоген, а также матриксные металлопротеиназы.
Урокиназный и тканевой активаторы плазминогена, а также плазминоген представляют собой сериновые протеазы, которые продуцируются в виде одноцепочечного предшественника и активируются процессингом на а и ß цепи