Биоразнообразие бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas и создание молекулярной системы их идентификации и диагностики

• Автор: Зотов, Василий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 180 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ -
ВВЕДЕНИЕ -
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Азотфиксирукнцие клубеньковые бактерии рода Rhizobium -
1.1. Структура рнзобиального генома: хромосома и плазмиды. Генетические рекомбинации -
1.2. Понятие “Вида” для ризобий -
1.3. Таксономия Ризобий -
1.4. Генетическое разнообразие, основанное на “аксессорных” симбиотических генах:
1.4.1. Гены фиксации азота (nif и fix) -
1.4.2. Г ены клубенькообразования -
1.5. Филогенетические и биогеографические заключения, основанные на анализе ядерных и акцессорных генов -
1.6. Идентификация природных популяций ризобий -
1.7. Экологическая значимость несимбиотических штаммов Rhizobium -
1.8. Разнообразие популяций: -
1.8.1. Ризобии клевера (Trifolium spp.) -
1.8.2. Ризобии ГПИ гороха (Pisum), бобов (Vicia), чечевицы (Lens) и чины (Lathyrus) -
1.8.3. Ризобии фасоли (Phaseolus spp.) -
1.8.4. Ризобии козлятника (Galega spp.) -
Глава 2. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas -
2.1. Бактерии рода Xanthomonas -
2.2.Полифазная таксономия бактерий рода Xanthomonas -
2.3. Разнообразие внутри рода Xanthomonas на уровне генома и патовариантов -
2.4. Использование ДНК фингерпринтинга для оценки геномного разнообразия ксантомонад -
Глава 3. Методические подходы к идентификации и оценки генетического разнообразия бактерий -
3.1. От групп перекрестной инокуляции к полифазной таксономии -
3.2. Фенотипические методы: -
3.2.1.Тесты на восприимчивость растений к патогенным и симбиотическим бактериям -
3.2.2. Культуральные, физиологические и биохимические признаки -
3.2.3. Мультилокусный электрофорез ферментов (MLEE) -
3.2.4. SDS-полиакриламидный гель электрофорез клеточных белков (SDS-PAGE) -

3.2.5. Серологические признаки -
3.3. Генотипические методы диагностики: -
3.3.1. ДНК-ДНК гибридизация нуклеиновых кислот - 5
3.3.2. Анализ плазмидного состава -
3.3.3. Рестрикционный анализ бактериальных геномов (RFLP и PCR-RFLP) -
3.3.4. Техники ДНК-фингерпринтинга: гер-ПЦР, Eric-ПЦР, Вох-ПЦР, RAPD, ISSR,
ПЦР со специфическими праймерами, Insertion Sequences (IS-ПЦР), tRNA-ILP -
3.3.5. Мультилокусный анализ белок-кодирующих генов (MLSA) -
3.3.6. Анализ нуклеотидного полиморфизма гена 16S рРНК и межгенного региона рибосомального кластера 16S-23S рРНК (ITS). Риботипирование. -
3.3.7. Биоинформационный анализ данных (программное обеспечение и интернет-ресурсы) - 80 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Материалы и методы исследования -
4.1. Объекты исследования: фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas и симбиотические бактерии рода Rhizobium -
4.2. Выделение и хранение чистых культур клубеньковых бактерий -
4.3. Проверка тестовых растений на восприимчивость к взаимодействию
с клубеньковыми бактериями -
4.4. Оценка конкурентоспособности штаммов клубеньковых бактерий -
4.5. Определение азотфиксирующей активности клубеньковых бактерий на интактных клубеньках -
4.6. Изучение физиолого-биохимических свойств изолятов ризобий -
4.7. Генетический анализ: -
4.7.1 Выделение бактериальной геномной /(НК -
4.7.2. Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, gyrB, nodD, межгенных симбиотического иг/D-K региона и хромосомного /гш-региона -
4.7.3. Анализ нуклеотидных последовательностей межгенного региона 16-23S рРНК (ITS) при помощи техник RFLP и прямого секвенирования ПЦР-продуктов -
4.7.4. In-silico анализ генетического разнообразия бактерий с помощью метода RFLP -
4.7.5. Анализ полиморфизма длин амплифицируемых фрагментов (AFLP) -
4.7.6. Single adapter AFLP с использованием одной из редкощепящих эндонуклеаз ХЬаУХтаИ -
4.7.7. Ферментативная очистка фрагментов ДНК перед секвенированием -
4.8. Биоинформационный анализ данных -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. Оценка генетического разнообразия бактерий рода Xanthomonas -
5.1. Анализ saAFLP - новый подход к изучению генетического разнообразия симбиотических и фитопатогенных бактерий на внутривидовом уровне -
5.2. hin-регион - новый таксономический маркер для идентификации и диагностики фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas -
5.3. Структура и генетическое разнообразие /нл-региона у бактерий рода Xanthomonas, поражающих рапс и горчицу в России -
5.4. In-silico анализ нуклеотидного полиморфизма hin-региона ксантомонад -
Глава 6. Оценка разнообразия природных популяций бактерий рода Rhizobium из различных эколого-географических зон Украины -
6.1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства изолятов клубеньковых бактерий -
6.2. Тесты на восприимчивость бобовых растений к изолятам клубеньковых бактерий -
6.3. Установление родового и видового статуса изолятов путём анализа нуклеотидного полиморфизма гена 16S рРНК -
6.4. Оценка генетического разнообразия ризобий на внутривидовом уровне:
6.4.1. Анализ нуклеотидного полиморфизма межгенного региона 16-23S рРНК (ITS) -
6.4.2. ДНК-фингерпринтинг saAFLP (Xmail) -
6.4.3. hin-регион - новый таксономический маркер для идентификации и диагностики симбиотических бактерий рода Rhizobium -
6.4.4. Структура и генетическое разнообразие й/л-региоиа у бактерий рода Rhizobium -
6.5. Экспресс-метод оценки эффективности симбиотической системы «Phaseolus vulgaris - Rhizobium sp. bv. phaseoli» -
6.5.1. Анализ нуклеотидного полиморфизма гена gyrB -
6.5.2. Анализ нуклеотидного полиморфизма гена nod -
6.5.3. Анализ нуклеотидного полиморфизма межгенного региона л;ДЭ-К -
6.6. Генетическое разнообразие природных популяций клубеньковых бактерий рода Rhizobium, как основа высокоэффективных симбиозов для современной агробиотехнологии -
ЗАКЛЮЧЕНИЕ -
ВЫВОДЫ -
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ -

Глава 2. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas
2.1. Бактерии рода Xanthomonas
Ксантомонады - бактерии, представляющие семейство Xanthomonadaceae, которые включают виды из родов Xanthomonas и Xylella (которые вызывают болезни растений), а также виды из рода Stenotrophomonas (один из которых Stenotrophomonas maltophilia, является оппортунистическим патогенном человека).
Xanthomonas (от греческого xanthos, означающий “жёлтый”, и monas - “существование”) - большой род Грамм-отрицательных, жёлто-пигментированных бактерий, которые ассоциированы с растениями. Данный род, принадлежащий к у-протеобактериям (Jun etal., 2007), включает в себя 27 видов (Рис.2.1), которые в общей сложности вызывают серьёзные заболевания у 400 растений-хозяев, включающих широкое разнообразие экономически важных сельскохозяйственных культур, таких как рис, цитрус, банан, капуста, томат, перец, и фасоль. Отдельные виды могут содержать в себе несколько патоваров, т.е. патогенных вариантов внутри вида, которые определяется характерным растением-хозяином и/или тканевой специфичностью (Parkinson et al., 2007). Патогенные виды и патовары демонстрируют высокую степень специфичности к растению-хозяину, а также и к его тканям, поражающие либо ксилемные элементы сосудистой системы либо межклеточное пространство мезофильной паренхимы тканей хозяина (Рис.2.2). Например, штаммы вида Xanthomonas campestris включают хозяин-специфичные патовары, которые заражают различные крестоцветные, паслёновые и другие виды растений, тогда как штаммы вида Xanthomonas oryzae поражают рис и некоторые его дикие родственные формы. Оба вида включают патовары, которые либо вторгаются в сосудистую систему (например, X. oryzae pv. oryzae и X. campestris pv. campestris) или колонизируют межклеточное пространство паренхимы тканей (например, X. oryzae pv. oryzicola и X. campestris pv. armoraciae).
Заболевания, вызываемые штаммами Xanthomonas spp., часто начинаются с заражения семян, хотя патогены могут распространяться на здоровые растения посредством сельскохозяйственных практик, таких как обрезка и опрыскивание грядок с рассадой дождевой водой с формирование аэрозолей, которые могут нести в себе бактерии из соседних заражённых полей, либо с инфицированной почвой или с насекомыми. Эти бактерии сначала растут эпифитно (т.е. на поверхности листьев), а затем проникают в хозяина через секреторные органы (гидатоды) или ранки, распространяясь системно через сосуды, либо через устьица, колонизируя затем мезофильную паренхиму.