Роль PEDF в образовании фибриллярных внеклеточных структур при миопии

• Автор: Минкевич, Наталья Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

1. ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ: ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И УЧАСТИЕ В МЕТАБОЛИЗМЕ (Обзор литературы)
1.1. Введение
1.3. Структура PEDF и кодирующего его гена
1.3.1. Ген PEDF человека
1.3.2. Пространственная структура молекулы PEDF
Расположение поверхностных зарядов
1.3.3. PEDF-член семейства неингибиторных серпинов
1.3.4. Степень фосфорилирования молекулы PEDF влияет на его антиангиогенную и нейротрофную активности
1.3.5. Внутриядерная локализация PEDF
1.3.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора PEDF
1.4. Эффекты, оказываемые PEDF на клетки и ткани различного происхождения
1.4.1. Дифференцирующее действие PEDF и его влияние на метаболизм раковых клеток
1.4.2. Нейропротекторное действие PEDF
1.4.3. Антиангиогенное действие PEDF
1.4.4. Проапоптотическая активность PEDF
1.4.5. PEDF как перспективный терапевтический агент
1.5. Рецепторы PEDF
1.5.1. PEDF-R
1.5.2. Ламининовый рецептор
1.5.3 Взаимодействие с F1-ATP синтазой
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Введение
2.2. Тенонова капсула как объект для прижизненного исследования патологии склеры
2.3. Различное содержание изоформ фактора PEDF в тканях близоруких людей и в тканях контрольной группы
2.4. PEDF45 является продуктом деградации PEDF50
2.5. В тканях миопических глаз PEDF устойчив
к ограниченному протеолизу собственньми ферментами организма
2.6. Мутационные замены не являются причиной устойчивости PEDF к ограниченному протеолизу
2.7. В теноновых капсулах миопических глаз часть PEDF присутствует в водонерастворимом состоянии
2.8. Иммуногистохимические исследования образцов тканей склеры и теноновой капсулы.

2.9. Полноразмерная изоформа рекомбинантного PEDF
является малорастворимой
2.10. PEDF-(44-418) является амилоидогенным белком
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Сорбенты
3.1.3. Антитела и адьюванты
3.1.4. Ферменты
3.1.5. Штаммы, клеточные линии и плазмидные векторы
3.1.6. Наборы готовых реактивов
3.1.7. Микробиологические среды и буферы
3.2. Методы
3.2.1. Сбор клинического материала
3.2.2. Выделение и очистка белковых препаратов
3.2.3. Определение концентрации белка
3.2.3.1. Метод Лоури-Фолина
3.2.3.2. Метод Бредфорд
3.2.4. Получение поликлональных антител к пептидным фрагментам PEDF
3.2.4.1 Иммунизация подопытных животных
3.2.4.2 Очистка поликлональных антител
3.2.5. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле
3.2.6. Вестерн-блоттинг
3.2.6. 1. Электроблоттинг белков
3.2.6.2 Определение иммуно-реактивных белков
3.2.7. Количественное определение PEDF
3.2.8. Иммуногистохимические исследования
3.2.9. Поиск мутационных замен в генеpedf
3.2.9.1. Получение кДНК PEDF

3.2.9.2. Полимеразная цепная реакция
3.2.9.3. Лигирование
3.2.9.4. Приготовление компетентных клеток E. coli
3.2.9.5. Трансформация компетентных клеток E. coli
3.2.9.6. Отбор рекомбинантных клеток при помощи ПЦР
3..2.9.7. Выделение плазмиды
3.2.9.8. Определение нуклеотидных последовательностей
3.2.10. Получение рекомбинантного PEDF
3.2.10.1 Клонирование PEDF
3.2.10.2 Наработка PEDF в бакуловирусной системе
3.2.10.3 Контроль экспрессии рекомбинантных белков
3.2.10.4. Выделение рекомбинантных белков из клеток насекомых
3.2.11. Атомно-силовая микроскопия PEDF
3.2.12. Дот блот анализ
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

операциях склеропластики. Образцы были подразделены на «экспериментальную» и «контрольную» группы. Образцы, составившие «экспериментальную» группу, были получены от людей, страдающих близорукостью различной этиологии, степени и осложненности, всего был исследован 101 образец. «Контрольная» группа включала образцы, полученные от здоровых людей (травматические ткани), людей со слабой степенью дальнозоркости и(или) косоглазия, всего исследовано 34 образца. В рамках исследования получались экстракты водорастворимых белков, содержащихся в ткани теноновых капсул. Суммарные белки разделяли по массе методом электрофореза по Лэммли в денатурирующих условиях в 12% ПААГ, затем разделенные белки переносили на мембрану из поливинилиденфторида и определяли присутствие целевого белка методом Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных кроличьих антител против полноразмерного РЕОР.
Во всех образцах «контрольной» группы, а также в некоторых «экспериментальных» образцах помимо полноразмерного фактора РЕБР с молекулярной массой около 50 кДа было обнаружено присутствие еще одного белка, специфически взаимодействовавшего с антителами против РЕБР (рис. 2). Его электрофоретическая подвижность соответствовала протеину с молекулярной массой около 45 кДа. Так как, помимо этих двух белков, в исследуемом белковом пуле не наблюдалось гибридизации с анти-РЕВР а
специфичность взаимодействия белка с молекулярной массой 45 кДа с используемыми антителами была сравнима с таковой для самого фактора, мы сделали вывод о присутствии в этих образцах одновременно двух изоформ фактора РЕВЕ. Одна из них является полноразмерным протеином, а вторая - предположительно его укороченным фрагментом.
При исследовании результатов вышеописанных экспериментов была выявлена разница между содержанием РЕВГ'45 в образцах «контрольной» и «экспериментальной» групп. В «контрольных» образцах РГ.ВК45 всегда обнаруживался, и присутствовал в количествах, составляющих от одной второй до одной третьей части от суммарного содержания РЕОР. В то же время в образцах «экспериментальной» группы изоформа РЕВР45 идентифицировалась в значительно меньших количествах, от одной десятой и