Экспериментальная ДНК-вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека

• Автор: Максютов, Ринат Амирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Список используемых сокращений
2. Введение
3. Обзор литературы
3.1. Краткая характеристика натуральной оспы
3.2. Разработка противооспенных вакцин
3.2.1. Первое поколение живых противооспенных вакцин
3.2.2. Второе поколение живых противооспенных вакцин 1 б
3.2.3. Третье поколение живых противооспенных вакцин
3.2.4. Четвертое поколение живых противооспенных вакцин
3.2.5. Белковая субъединичная противооспенная вакцина
3.2.6. Противооспенная ДНК-вакцина
3.3. Применение ДНК-вакцин
3.3.1. Конструирование ДНК-вакцины и факторы, влияющие на ее эффективность
3.3.2. Механизм действия ДНК-вакцины
3.3.3. Клинические испытания ДНК-вакцин 3
3.3.4. Перспективы применения ДНК-вакцин в профилактике ортопоксвирусных 37 инфекций человека
4. Материалы и методы
4.1. Материалы
4.2. Компьютерный анализ
4.3. Амплификация ДНК
4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора Gel 44 Extraction Kit фирмы “QIAGEN”, Германия
4.5. Лигирование
4.6. Приготовление компетентных клеток E.coli
4.7. Трансформация компетентных клеток E.coli
4.8. Выделение плазмидной ДНК в препаративном варианте
4.9. Выделение плазмидной ДНК в аналитическом варианте
4.10. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
4.11. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле
4.12. Секвенирование ДНК
4.13. Очистка плазмидной ДНК от эндотоксинов центрифугированием в

двухступенчатом градиенте CsCl
4.14. Очистка плазмидной ДНК от эндотоксинов при помощи набора EndoFree 47 Plasmid Giga Kit фирмы “QIAGEN”, Германия
4.15. Иммунизация мышей ДНК-вакцинами
4.16. Измерение титра вируснейтрализующих антител
4.17. Измерение титра антител к ВОВ
4.18. Реакция бласттрансформации лимфоцитов
4.19. Изучение протективного иммунного ответа
4.20. Статистическая обработка данных
5. Результаты и обсуждение
5.1. Выбор генов ВНО для конструирования ДНК-вакцины
5.2. Определение оптимального способа иммунизации ДНК-вакцины в 66 зависимости от использованного промотора для эукариотической экспрессии на развитие протективного иммунного ответа
5.3. Исследование влияния изменения кодонового состава гена, 73 оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, на протективную эффективность ДНК-вакцины
5.4. Оценка иммуногенности и протективной эффективности поливалентной ДНК- 80 вакцины на основе генов A30L, MIR, F8L, A36R и B7R ВНО
6. Заключение
7. Выводы
8. Список литературы

1. Список используемых сокращений
АПК - антигенпрезентирующая клетка
БОЕ - бляшкообразующая единица
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВИО (VARV) — вирус натуральной оспы
BOB (VACV) - вирус осповакцины
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ВОК (CPXV) - вирус оспы коров
BOO (MPXV) - вирус оспы обезьян
ВЭ (ECTV) - вирус эктромслии
ИЛ — интерлейкин
ИНФ - интерферон
ИФА - иммуноферментный анализ
ОРТ - открытая рамка трансляции
п.н. - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
Трис — трисгидроксиметиламинометан
ФИО - фактор некроза опухолей
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭСК - эмбриональная сыворотка коров
CEV - cell-associated enveloped virus (внеклеточный вирус связанный с клеточной мембраной)
CMV - цитомегаловирус
CR - crescent (серповидное образование)
dNTPs - дезоксинуклеозидтрифосфаты
EEV - extracellular enveloped virus (внеклеточный покрытый оболочкой вирион) НА - гемагглютинин
IEV - intracellular enveloped virus (внутриклеточный вирион)
IMV - intracellular mature virus (внутриклеточный зрелый вирус)
IV - immature virus (незрелый вирус)
LB - среда Лурия-Бертани LDso - летальная доза, 50%
МНС - main histocompatibility complex (главный комплекс гистосовместимости) MOPS — морфолиниропансульфокислота

вследствие чего CpG-мотивы не взаимодействуют с иммунной системой и не стимулируют выработку ИЛ-12 (Torres et al., 1997). Таким образом, открывается еще одно возможное применение ДНК-вакцин - модулирование иммунного ответа, направление его по пути Т-хелперов 1-го или 2-го типа в зависимости от требований терапии.
Важным достоинством ДПК-вакцины является ее способность, наравне с живыми аттенуированными вакцинами, активировать CD8+ Т-лимфоциты (Т-киллеры) посредством МНС-I пути презентации антигена, и тем самым обеспечивать гибель инфицированных клеток. При этом ДНК-вакцина считается более безопасной, нежели живая вакцина.
Секреция белка соматическими клетками, трансформированными ДНК-вакциной, при помощи Т-хелперов 2-го типа обеспечивает индукцию В-лимфоцитов и формирование гуморального иммунитета. При этом способность ДНК-вакцины стимулировать выработку вируснейтрализующих антител говорит о том, что наработанный in vivo белок имеет нативную конформацию (Sakhatskyy et al, 2006).
Отличительной особенностью любой успешной вакцины является ее способность вызывать, долговременную иммунологическую память. Показано, что ДНК-вакцины способны приводить к формированию иммунологической памяти гуморального иммунитета, но в значительной мере это зависит от используемого антигена и способа доставки вакцины (Gurunathan et al., 2000). Относительно клеточного иммунитета, в исследовании (Akbari et al., 1999) показано, что в течение 40 недель после иммунизации ДНК-вакциной сохранялся повышенный, уровень антигенспецифичных CD4+ Т-лимфоцитов, a CD8+ Т-киллерная активность может сохраняться до 68 недель после вакцинации (Raz et al., 1994).
3.3.3. Клинические испытания ДНК-вакцин
В доклинических исследованиях на модельных животных ДНК-вакцины показали высокую иммуногенность и доказали свою протективную значимость против вирусов из семейств флавивирусов (Schmaljohn et al., 1997; Pan et al., 2001;Putnak et al., 2003), филовирусов (Vanderzanden et al., 1998; Riemenschneider et al., 2003), поксвирусов (Hooper et al., 2004; Heraud et al., 2006; Sakhatskyy el al., 2006), буньявирусов (Hooper el al., 1999; Hooper et al., 2001), тогавирусов (Bennett el al., 1999), вируса бешенства (Lodmell et al.,
2002), вируса ящура (Benvenisti et al., 2001), папиломавирусов (Stanley et al., 2001; Moore et al., 2002), вируса гриппа (Webster et al., 1994; Kodihalli et al., 1997), ВИЧ (Kent et al, 1998; Fuller et al., 2002) и герпесвирусов (Kondo et al, 2004); бактерий, вызывающих